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做电泳实验需要知道的基础知识

大耳朵兔兔

2022/12/29

毛细管电泳（CE）

＊样品制备
- 样品必须完全溶解于上样缓冲液，否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。
- 样品缓冲液包含盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。
- 样品缓冲液可以分装成小部分冻存。
- 缓冲液加到凝胶上之后才能点样。
- 样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青FF 。
＊标准分子质量
- 标准分子质量应同时电泳，用来检测电泳进展以及分析结果。
- 使用相适应的标准分子质量。
- 胶连同分子质量标准物一起拍照。标上各条带的大小。
- 标准分子质量有带标记的与不带标记的两种。标记可以是荧光、发光体或者放射性元素。如果手边没有带标记的标准物，可以将染色后的胶与事后标记的印迹相比较。
- 在每一块胶的同一泳道点上标准物。把标准物加在第一个泳道，就能知道胶的方向。
- 点上正对照与负对照。
＊样式
- 琼脂糖凝胶一般以水平方向进行电泳，而聚丙烯酰胺凝胶则是以垂直方向进行电泳。潜水型胶是一种水平方向胶，凝胶被浸淹在电泳槽的底部。
- 凝胶可以制成多种大小。测序胶必须制成大胶，但是对于大多筛选与转移用胶，甚至包括双向凝胶来说，只要不是把分子量相近的条带区分割，小型胶就可以了。
- 毛细管电泳利用开口狭小的毛细管来进行DNA 、蛋白质和其他小分子的自动高效分离。分离是与检测分析相连，就像色谱仪器一样。只有专门实验室才有毛细管电泳设备。
＊凝胶
- 聚丙烯酰胺VS 琼脂糖。尽管凝胶电泳可以在滤纸、醋酸纤维素、淀粉或者其他基质上进行，大多数研究者还是只采用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。两种都是多孔性胶，像分子筛样起作用（聚丙烯酰胺或者琼脂糖的百分比越高孔越小）。理论上，任何一种都可以用来分离DNA 、RNA 或者蛋白质。但是，聚丙烯酰胺在低百分比浓度时很软，难以用手操作。一般采用高百分比浓度，用以分析蛋白质和小核苷酸。
- 低百分比琼脂糖凝胶相对较硬，易于操作，用来分离目的分子，如DNA和RNA或者巨大的蛋白质和蛋白质复体。
- 胶的浓度必须与片断大小相适应。
- 每次切去胶的同一小角。这样，万一胶掉落、翻转或在转移过程中放置凝胶，都能给定位做参考。
＊缓冲液
- 大多数电泳缓冲液配成高浓度母液，在电泳前稀释。
- 每一种缓冲液在某一电流时会有特定的电压。要认识每一种缓冲液的特性，这样，出错时，就马上可以注意到。
＊电源
- 电源输出有几种模式：稳压(mV) 、稳流（安培，或者简称安）以及稳功率（瓦特，瓦）。许多型号允许设定程序，在各种模式之间自动转换。这样可以使用最佳的电压（在电泳过程中可能发生变化）同时不超出容量。
- 不是所有的电源输出装置都相同，所以不能简单地将电泳装置接到任意装置上。要清楚你需要什么电流或者电压，然后找出需要的装置。
- 大多数实验室都有不止一个电源装置用于测序胶（要求高电压）、电泳转移（要求高电流）以及用于琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳（使用大范围的电压）的装置。很少有电源装置能同时满足所有的要求。
- 变性蛋白胶与DNA和RNA胶中的样品会从负极（阴极）移到正极（阳极）。用红色导线接正极（＋），黑色导线接负极（一）。可以用同一个电源输出装置同时进行几块胶的电泳，但是没问过其他人前不要这样做，因为电泳条件会发生变化。
- 设置闹钟提醒自己察看胶。特别是当你要察看低分子质量的分子时，样品很容易跑出胶进入缓冲液中。
- 接触任何东西前，确信电泳装置必须处于断电状态。如果电源没被切断，不要进行任何操作！电流效应
固定
- 凝胶是否需要固定取决于用途。需要染色的胶一般需要固定，而用于转移的胶则不需要固定。
＊干燥
- 通过出去胶上的水，胶基质变薄。干燥之后的胶在放射自显影后条带更清晰。
- 在凝胶干燥仪上干燥一块胶不需1小时。凝胶干燥仪可以加热，从而加快干燥过程。
＊染色
- DNA与RNA的染色可以通过在电泳前把染料加到样品中完成，也可以在事后染色。
- 蛋白质胶在电泳后染色。
＊记录
- 凝胶经溴化乙锭染色后的Polaroid照片与蛋白质凝胶的35 mm照片是最常用的记录方式。
- 数字记录与分析系统最常使用，所有数据可以直接用来演示。
- 各种转移的记录方式取决于体系与实验。例如，放射自显影与化学发光结果可以记录在X射线胶片上，而信号可用光密度计定量。
＊确定分子质量
- 蛋白质的分子质量可用SDS-PAGE确定，而DNA与RNA的分子质量可以由琼脂糖凝胶电泳来确定。对某一分子而言，其分子质量的对数与其Rf（相对迁移距离）存在线性关系。以标准物的迁移距离对其分子质量的对数作图，得到标准曲线，而样品的Rf 值一也就是分子质量一可以由图外推得到。
  1.制胶，胶的浓度应最适宜分离分子质量相近的分子。同时电泳分子质量标准物，其范围涵盖有目的分子的大致大小。
  2.跑胶，防止染料前沿跑出胶的边际。
  3.胶染色，拍照。如果样品是放射性标记的，你可以使用放射性标记的标准物或者把胶与放射自显影胶片相比较。4.测定从样品孔到每一标准条带的距离。计算每个数值的对数，画到常规图纸的Y 轴上。X 轴上是迁移的距离（以厘米计最方便）。对大多数标准物条带应该得到一条盲线。
  5.把样品迁移距离画到图上。外推标准曲线，确定分子质量。

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