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常用的标签蛋白大盘点
Ins_bf0c01c3
2023/08/23
私聊
生命科学仪器综合讨论
标签蛋白
主要分为两类:一类为自发荧光标签,它们主要应用于目标蛋白表达代谢的动态监测,另一类就是主要辅助蛋白质分离纯化的亲和吸附标签。本期盘点的内容主要针对亲和吸附标签。
亲和吸附标签不仅便于对融合蛋白的检测与纯化,而且可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响:可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠。
常用亲和吸附标签蛋白
①
His
His
标签被认为是蛋白纯化的首选标签,它由六个组氨酸残基(
HHHHHH
)组成,分子量极小只有
~0.84KD
,可插入在目的蛋白的
C
末端或
N
末端。
His
标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子(如
Cu
、
Zn2+
、
Ni2+
、
Co
等)与
His
融合蛋白上的
His
标签的配位作用实现目标蛋白的分离。
N-
端的
His
标签与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;
His
标签很小,几乎不影响目标蛋白的理化性质及其可溶性,在目标蛋白结晶后对其蛋白结构几乎没有影响;并且其免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行抗体制备。
然而,并不是所有的蛋白质都可以与
His
标签融合后,采用固定化金属离子亲和层析分离纯化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然发生的组氨酸丰富区域,在固定化金属离子亲和层析时可能会导致其他蛋白的非特异性结合
;
目标蛋白含有金属离子,一般也不采用
His
标签与固定化金属离子亲和层析。
②
FLAG
:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/flag-tag-protein-expression
FLAG
标签是由
8
个氨基酸
( DYKDDDDK)
组成的一个短肽,分子量很小,因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域,也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。目的蛋白
N
端融合了
Flag
多肽后,
C
末端还可以融合其他模块或者不同的亲和配体。
在
FLAG
标签的基础上,将
3
个
FLAG
标签串联在一起,便形成了一个由
22
个氨基酸组成的
3
×
FLAG
标签。与原始
FLAG
标签相似,
3
×
FLAG
标签的分子量很小,只有
2.7 kDa
,天然亲水,因而不会改变融合蛋白的功能,且同时含有一个肠激酶切割位点,便于除去标签。更为重要的是,该标签具有更高的检测敏感性,特别适合于哺乳动物细胞表达系统中低表达水平蛋白质的检测。而对于某些需要维持生物活性的小分子目标蛋白,在其免疫沉淀纯化中,结合一个高效接头结构的
3
×
FLAG
标签表现出更显著的纯化效果。
③
GST
:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression
GST
标签由
211
个氨基酸组成,大小约为
26kDa
,广泛用于重组蛋白融合表达与亲和纯
化。
GST
标签可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达,起到提高表达量的作用;
GST
可在一定程度上增大融合蛋白的可溶性,不仅促进了目标蛋白的正确折叠,提高了蛋白产量,而且有助于后续的蛋白纯化;
GST
标签可很好的保留融合蛋白的抗原性和生物活性,并可使用不同的蛋白酶方便去除。但
GST
易于同源二聚化,从而增加纯化难度,且相对短肽标签,分子量较大,在融合表达时可能会影响蛋白功能,并增加细胞代谢负担。
④
c-Myc
:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/myc-tag-protein-production
c-Myc
标签蛋白(
EQKLISEEDL
),其大小为
1.2kDa
,它作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中可识别其相应的抗体。
c-Myc
标签常应用于
WB
、免疫沉淀和细胞流式术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。但需要注意的是
Myc
标签蛋白本身即为人的
Myc
基因的一部分,所以应尽量避免将该蛋白应用于人的细胞或组织相关实验。
⑤
HA
:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/ha-tag-protein-production
HA
标签(氨基酸序列:
YPYDVPDYA
)是?段来源于?流感病毒?凝素(
HA
)蛋?第
98
~
106
位氨基酸的短序列,分?量为
1.1 KDa
,是?前?泛应?的表位标签之?,能形成强烈的抗体识别位点。通过分??物学?段将
HA
标签融合到?的蛋?的
C
端或
N
端后,抗
HA
标签抗体可?于
HA
标记的靶蛋?的检测、分离和纯化,??需蛋?特异性抗体或探针。
HA
对外源蛋白的空间结构影响小,容易构建成标签蛋白融合到
C
端或者
N
端。
如何选择合适的亲和吸附标签?通常需要注意以下
3
点:
① 根据实验目的选择合适的标签,例如蛋白纯化选择
His
标签,
WB
通常选择
FLAG
② 确定标签蛋白对目的蛋白的表达是否产生干扰、
③ 确定标签蛋白标记的位置是在目的蛋白的
N
端还是
C
端。
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