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亲和层析技术的原理？亲和纯化蛋白的注意事项有哪些？

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2023/09/21

生命科学仪器综合讨论

亲和层析技术的原理：

亲和分析是利用生物聚合物与基础可逆结合的原理，通过共价键将基础与载体牢固结合而成的分析系统。这种可逆结合的作用主要取决于生物聚合物对其基础的空间结构的识别。受体蛋白、载体蛋白、外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体、核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。它具有高效、简单、快速的优点，是目前分离纯化蛋白质最理想的方法。

在亲和色谱中，在影响蛋白质（或标签）与其配体结合的情况下，将蛋白质装载在柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白质与固定相互作用的情况下，清洗组合蛋白质。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白/蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合，取代目标蛋白，这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。

亲和色谱配体和条件

需纯化的蛋白配体洗脱条件

抗体（抗原特异性）抗原肽游离肽

多聚组氨酸标签蛋白Ni2+或Co2+咪唑或游离组氨酸

FLAG标签蛋白FLAG特异性抗体FLAG肽或低pH值

GST标签蛋白还原型谷胱甘肽游离谷胱甘肽

Myc标签蛋白Myc特异性抗体低pH

抗体（类特异性）蛋白A、G和L或精蛋白pH极端值

DNA结合蛋白肝素高离子强度

亲和纯化蛋白的注意点：

a. Ni柱进行蛋白纯化时注意点：

(1)避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，等等；

(2)各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；

(3)各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；

(4) 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；

(5)在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；

(6)缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）

(7)应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；

(8)缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；

(9)可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）

(10)可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；

b. gst柱进行蛋白纯化时注意点

(1)在细胞裂解时，加入终浓度1–10 mM DTT可以显著提高GST融合蛋白的结合效率，在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1–10 mM DTT，可以提高蛋白纯度，但是会导致其产率降低

(2)超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与介质结合。

(3)在pH值低于6.5或高于8.0结合效率会降低，使用前需用pH6.5～8.0的Buffer如PBS进行平衡；

(4)增大Elution Buffer的pH值。Elution Buffer的pH值调至pH 8–9可以提高洗脱效率而不需要增加glutathione的浓度；

(5)增加Elution Buffer的离子强度。加入0.1–0.2 M NaCl能提高洗脱效率；

(6)Elution Buffer中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍GST融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside可以显著增加洗脱效率

c. proteinA柱进行蛋白纯化时注意点

(1)介质的选择A,G or 其他，其结合能力的选择

(2)上样流速尽量小，让Protein G和抗体有充分的结合时间

(3)在低pH值洗脱后，快速中和。

(4)长时间保存加入0.02-0.05％叠氮钠；

(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集。

(6)抗体纯度不够，杂蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。

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