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Fitc标记抗体:原理、方法及注意事项的详解
Ins_bf0c01c3
2024/01/11
私聊
生命科学仪器综合讨论
Fitc
标记抗体是一种广泛应用于生物医学研究的工具,它结合了荧光染料和抗体的特性,为研究者提供了可视化、定量和定位细胞和组织中目标分子的能力。了解
Fitc
标记抗体的原理、方法及注意事项,是成功应用这一技术的关键。
FITC
标记抗体的原理
FITC
异硫氰酸荧光素是目前较为常用的标记抗体的方法,
FITC
一般呈黄色、褐色或褐黄色粉末或结晶,性质稳定在低温中能保存数年。在碱性条件下,
FITC
的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基共价结合,形成
FITC-
蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个抗体分子上最多能标记
15~20
个
FITC
分子,被标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力,在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光,通过荧光显微镜进行观察或利用流式细胞仪分析,从而对抗原进行定性、定位或定量。
FITC
标记抗体方法
FITC
抗体标记主要有
Marshall
直接标记法、
Chadwick
间接标记法、改良标记法和透析法四种。
1
、
Marshall
直接标记法
①抗体的准备:取提纯的
Ig
溶液测定蛋白质含量,置于三角烧瓶中加入生理盐水和
0.5mol/L pH9.5
碳酸盐缓冲液,冰槽中搅拌
5~10min
;
②荧光素的准备:按每毫克蛋白质加
0.01~0.02mg
的
FITC
计算,准确称取后加入抗体溶液中;
③标记:边搅拌边加入荧光素,避免粉末黏附于壁上,置于
4
℃冰箱或冰库继续搅拌
12~18h
;
④透析:结合完毕后,先将结合物以
3000r/min
离心
20min
,除去少量沉淀物后装入透析袋中再置于
pH8.0
缓冲盐的烧杯中透析过夜;
⑤过柱:取透析过夜的标记物,过葡聚糖凝胶
G-25
或
G-50
柱,分离游离的
FITC
,收集标记的荧光抗体进行鉴定。
2
、
Chadwick
间接标记法
①抗体的准备:
0~4
℃下,用
0.01mol/L pH8.0 PBS
将待标记的抗体蛋白溶液稀释到浓度为
30~40mg/ml
,置于三角烧瓶内放入冰槽中;
②荧光素的准备:按每毫克蛋白质加入
0.01mg
的荧光素称取,溶解于等量的
3%
重碳酸钠水溶液中;将抗体蛋白溶液与
FITC
溶液等量混合,在
0~4
℃中搅拌
18~24h
,充分搅匀;
③透析或过柱层析。
3
、改良法
①抗体的准备:取提纯的
Ig
溶液测定蛋白质含量,置于三角烧瓶中加入生理盐水和
0.5mol/L PH9.5
碳酸盐缓冲液,冰槽中搅拌
5~10min
;
②荧光素的准备:按每毫克蛋白质加
0.01~0.02mg
的
FITC
计算,准确称取后加入抗体溶液中;
③标记:边搅拌边加入荧光素,避免粉末黏附于壁上,置于
4
℃冰箱或冰库继续搅拌
12~18h
;
④用半饱和硫酸铵将标记的抗体蛋白沉淀分离,
3000r/min
离心
30min
,倾去上清液中的游离荧光素,再用缓冲盐水透析除去硫酸铵。将制备好的荧光抗体加
0.01%NaN3,
分装保存。
4
、透析法
①用
0.025mol/L PH9.2
碳酸盐缓冲液,将待标记的抗体蛋白稀释成
1%
浓度,装入透析袋中;
②用同一缓冲液将
FITC
制成
0.1mg/ml
的溶液,置于圆形容器内,并将透析袋浸没其中,
4
℃搅拌
24h
;
③取出透析袋中标记液。立即过葡聚糖凝胶
G-25
或
G-50
柱,除去游离荧光素,收集荧光抗体进行鉴定。
FITC
抗体标记注意事项
①
影响标记效率的因素有温度、时间、
pH
、荧光素和蛋白的量等,需注意控制;
②
荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光,搅拌速度应适当避免气泡的产生;
③
层析柱装柱注意正确操作,使柱体均匀、柱面平整,无气泡、裂隙;
④
上样和洗脱应做到
“前切”和“后切”。前切指柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品,后切指样品走至与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。
更多
抗体标记
详情可以关注义翘神州:
https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation
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