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深入了解GST标签:作用机理、优势与劣势以及常见问题解析
Ins_bf0c01c3
2024/01/11
私聊
生命科学仪器综合讨论
胱甘肽
S-
转移酶(
GST
)是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶,
GST
广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的一种解毒系统中,其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团,生成谷胱甘肽衍生物,具有降低化学反应活性的效应。在各种生物体内,
GSTs
是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶,分子量为
23
∽
29kDa
,由
200
∽
240
个氨基酸组成。有膜结合和胞液两种形式,以胞液
GSTs
为主。根据蛋白酶的一级序列、免疫原性、酶动力学和三、四级结构的性质,
GST
又可以分为多个亚类。
GST
标签作用机理
1
)应用于原核表达,作为一种高度可溶的蛋白,能增加外源蛋白的可溶性,在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用;
2
)
GST
标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性;
3
)
GST
在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂(如:盐酸胍或尿素等);
4
)
GST
融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具,其广泛用于研究蛋白质
-DNA
及蛋白质
-
蛋白质间的相互作用,也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究。
5
)
GST
标签的切除:①凝血酶:一种应用很广泛的蛋白酶,主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的
C
端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列,分别为
X4-X3-P-P[K]-X1
?
-X2
?和
X2-R[K]-X1
?,凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。②
Xa
因子:
Xa
因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别
I-E[D]-G-R-X1
序列,并将融合标签从其
C
末端切除。
GST
标签纯化蛋白的优劣势:
优势:
1.
适用范围广,可在不同宿主中表达;
2.
增强外源蛋白可溶性;
3.
可用不同的蛋白酶进行去除;
4.
有助于保持蛋白的抗原性与生物活性,提高外源蛋白的稳定性;
5.
特异性好,纯化方便且温和。
劣势:
1.
分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验;
2.
仅能纯化可溶性蛋白,若蛋白不可溶,则很难用变性的方法纯化。
GST
标签纯化蛋白常见问题解析:
问题一:
GST
融合蛋白的产量低或无法检测到
1
、原因:融合蛋白形成包涵体
解决方案:
①采用低温(
16
∽
25
℃)培养细胞,或者诱导过程中降低诱导剂的终浓度至
1mM
,或者缩短诱导时间。
②纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与
GST
标签蛋白纯化琼脂糖凝胶在摇床上轻摇
2
个小时或者更长时间(过夜),充分结合后上柱纯化。
2
、原因:融合蛋白可能失活
解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件,比如采用溶菌酶。
3
、原因:融合蛋白被蛋白酶降解
解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂,如
PMSF
。
4
、原因:融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来
解决方案:
①延长洗脱时间,或者增加洗脱液中还原性谷胱甘肽的浓度至
15mM
或者更高调节洗脱液的
pH
值至
8.0
∽
9.0
。
②在洗脱液中加入
Triton X-100
(终浓度
0.1%
)、辛基
-
葡萄糖苷(终浓度
2%
)或者
NaCl
(终浓度
0.1
∽
0.2 M
)。
问题二:洗脱液中有较多杂带
1
、原因:融合蛋白被蛋白酶降解
解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂如
PMSF
。
2
、原因:一些宿主蛋白,比如伴侣蛋白,可能会和融合蛋白互相作用
解决方案:
在洗涤液中加入
DTT
(终浓度
5 mM
)。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液
(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl)
,
37
℃振荡
10 min
3
、原因:过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合
解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件。
4
、原因:有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合
解决方案:优化洗涤条件:加入一些洗涤剂如
1% Triton X-100
、
1%Tween-20
、
0.03% SDS
或者
0.1% NP-40
可以降低非特异性吸附。优化洗涤液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附。
更多
GST
标签蛋白纯化
详情可以关注义翘神州:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression
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