仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
2
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
原创大赛
>
原创大赛公告
>
帖子详情
质粒抽提的基本原理及操作流程
Ins_f47ed2a0
2024/10/03
私聊
原创大赛公告
质粒抽提的基本原理及操作流程
⒈质粒抽提基本原理
在其中采用几种水溶液及其硅酸化学纤维膜(超滤膜柱)。 水溶液Ⅰ:50 mM果糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA,pH 8.0;水溶液Ⅱ:0.2 N NaOH / 1%SDS; 水溶液Ⅲ:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%乙醇。
水溶液Ⅰ
果糖是使飘浮后的大肠埃希菌不容易迅速堆积到水管的底端;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属材料正离子的螯合剂,其关键目地是以便鳌合二价金属材料正离子进而达到抑制DNase的特异性;可加上RNase A消化吸收RNA。
水溶液Ⅱ
此步为碱解决。在其中NaOH关键是以便融解体细胞,释放出来DNA,由于在强偏碱的状况下,细胞质产生了从两层膜结构工程向微囊构造的转变。SDS与NaOH联用,其目地是以便提高NaOH的强偏碱,一起SDS做为阳离子表活剂毁坏脂两层膜。那步要记牢二点:首位,时间不可以太长,由于在那样的偏碱标准下基因组DNA-p段也会渐渐地破裂;其次,务必温柔混和,要不然基因组DNA会破裂。
水溶液Ⅲ
水溶液III的功效是沉定蛋白质和中和反应。在其中醋酸钾是以便使钾离子换置SDS中的钾离子而产生了PDS,由于十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)碰到钾离子后变为了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS不是溶水的,一起1个SDS分子结构均值融合2个碳水化合物,钾钠正离子换置所造成的很多沉定大自然就将绝大多数蛋白沉定了。2 M的醋酸是以便中合NaOH。基因组DNA如果产生破裂,要是是50-100 kb尺寸的片段,就没有方法再被 PDS共沉淀了,因此碱解决的时间要短,并且不可猛烈震荡,要不然蕞终获得的质粒上都会有很多的基因组DNA渗入,琼脂糖电泳能够 观查到这条浓浓总DNA条带。75%乙醇关键是以便清理盐分和抑止Dnase;一起水溶液III的强酸碱性都是以便使DNA尽快融合在硅酸化学纤维膜上
⒉质粒抽提流程
⑴应用质粒提取试剂盒获取质粒时请参照实际试剂盒的操作指南。如Omega企业的E.Z.N.A.? Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin (质粒提取盒)。
⑵碱裂解手提式法:此方式适用少量质粒DNA的获取,获取的质粒DNA可立即用以酶切、
PCR
测序、银染编码序列分析。方式给出:
①接1%含质粒的大肠埃希菌体细胞于2mlLB培养液。
②37℃震荡塑造留宿。
③取1.5ml菌体于Ep管(离心管),以4000rpm抽滤3min,弃上清液。
④加0.lml水溶液I(1%果糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充足混和。
⑤添加0.2ml水溶液II(0.2mM/LNaOH,1%SDS),轻轻地旋转搅拌,放置冰浴5min.
⑥添加0.15m1预冷水溶液III(5mol/LKAc,pH4.8),轻轻地旋转搅拌,放置冰浴5min.
⑦以10,000rpm抽滤20min,取上清液于另翻新Ep管。
⑧添加等容积的异戊醇,搅拌后静放10min.
⑨以10,000rpm抽滤20min,弃上清。
⑩用70%酒精0.5ml清洗一回,吸干全部液体。
待沉定干躁后,溶解50ulTE缓冲液中(或60℃温育双蒸水)。
相关话题
1
如何选择合适的标定物进行卡尔?费休试剂的标定
2
标定卡尔·费休试剂时,如何确保标定物含水量的准确性
3
如何使用卡尔?费休试剂对酒石酸钠二水合物进行标定
4
标定卡尔·费休试剂时,如何保证环境湿度的相对稳定
5
如何判断酒石酸钠二水合物是否已经完全溶解
近期热榜
迎国庆送壕礼!十月发帖抢大疆云台
【官方邀请】高效液相色谱使用情况有奖调研
喜迎国庆!第十七届原创大赛超级原创日参赛奖励翻倍
丹纳赫四十周年寄语征集领大礼包
热门活动
【售后专场--招聘会】
第三届微课大赛投票进行中ing
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
赛默飞气相进样口气路结构拆解
第十三届原创
2020/08/19
【震惊】白嫖APPLE全家桶,就在新芝
活动
2021/12/02
建议积分商城 再上点礼品......
讨论
2012/01/30
【仪器心得】+气质连用仪7000D的使用心得
第十五届原创
2022/09/01
【20周年】我与仪器社区的缘
第十四届原创
2021/08/24
真空泵内部结构介绍
第十二届原创
2019/10/31
第十届原创大赛老手首篇金币已补发!
公告
2017/08/01
蛋白质谱样品前处理及注意事项
第十六届原创
2023/10/30
[仪器心得]【第十七届原创】紫外-可见分光光度计吸光度值“爆仓”后.....
第十七届原创
2024/10/10
饲料样本是否掺有尿素实验
第十七届原创
2024/10/10
重量法测定果胶物质时,如何提高沉淀的回收率
第十七届原创
2024/10/09
原子吸收分光光度计检测稀有金属和非稀有金属操作要点的区别
第十七届原创
2024/10/09
用一步法固相萃取结合液相色谱串联质谱法测定鲈鱼中孔雀石绿的操作心得
第十七届原创
2024/10/09
铁氧体材料在高频电磁干扰屏蔽中的局限
第十七届原创
2024/10/09
使用高效液相色谱检测茶多酚时,如何确定流动相比例和pH值
第十七届原创
2024/10/09
使用Stratagem EH5电磁系统的心得体会
第十七届原创
2024/10/09
同一个部门的人进门还让登记,宝宝很生气!
第十七届原创
2024/10/03
要想新员工学的快,培训技巧很重要!
第十七届原创
2024/10/04
再谈不符合项的整改
第十七届原创
2024/10/04
安捷伦TCD 测水怎么定量
求助
2024/10/08
纺织品色牢度沾色评级方式集锦及简介
第十七届原创
2024/10/08
悄悄告诉你 - 想做好能力验证组织机构的选择要正确
第十七届原创
2024/10/08
关于耐洗色牢度测试用皂洗罐的使用应注意哪些内容
第十七届原创
2024/10/06
新人一般多长时间可以参加能力验证啊?
求助
2024/10/04
吸波材料的两个吸收峰EAB值问题
求助
2024/10/03
假期第三天
原创
2024/10/03
“共和国勋章”获得者
原创
2024/10/03
枇杷果性凉味甘酸
原创
2024/10/03
每周至少要吃两次水产品
原创
2024/10/03
中国海警舰艇首次进入北冰洋海域
原创
2024/10/03
红叶送福吉祥如意
原创
2024/10/03
人生开关与生气
原创
2024/10/03
品牌合作伙伴
科研创新转化的问题,今日圆桌分享!
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...