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免疫荧光protocol-操作过程

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2024/10/08

1.固定：4%多聚甲醛500ul/孔，室温固定30min；

2.酸处理：吸出4%多聚甲醛，用PBS润洗一遍，加入含2mol/L HCl 的PBS溶液500ul/孔，室温1h（此步骤仅BrdU需要）；

3.透膜：吸出HCl,加入透膜液500ul/孔，37℃，1h；

4.封闭：封闭液（1%BSA,5‰tritonX-100的PBS溶液）室温，1h；

5.一抗过夜：一抗：封闭液＝3ul：500ul,4℃过夜；

6.一抗回收：EP管4℃保存；

7.一抗清洗：清洗液（1‰ TWEEN20,0.1‰tritonX-100的PBS溶液）500ul/孔，37℃，120rpm, 5min x 3；

8.二抗孵育：二抗：清洗液＝1 ：2000, 预混，避光，37℃，150rpm, 5min ；

9.二抗清洗：同一抗；

10.DAPI染色：DAPI ：清洗液＝ 1 ： 100 , 37℃，10 min ；

11.DAPI清洗：同一抗；

12.封片：擦净载玻片，滴上1滴抗抗荧光淬灭剂，吸净孔板里的液体，取出爬片倒放在载玻片上，中性树脂封片，待树脂干后可置于导航仪上观察；

13.观察后切片置于切片盒，4℃保存。

贴壁细胞：直接将细胞接种于爬片上，待细胞长至合适密度进行免疫荧光。

悬浮细胞：提前用500ul 1%PDL处理爬片（37℃，30min）,然后在细胞传代重悬后取30万细胞/400ul培养基接种于每张爬片上，细胞培养箱中放置2h后进行免疫荧光实验。

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