Cells：单细胞水平的多设备联用，破译足细胞损伤关键过程 | 用户成果速递

HORIBA（中国）

2024/09/20 09:43

德国纳米与显微技术研究所的科学家 Annalena Kraus，使用 HORIBA nanoGPS 跨平台共定位技术实现在单细胞水平上的多种显微分析设备联用。这项研究破译了肾小球足细胞损伤过程中的形态和化学变化的难题，对肾病研究有重大的临床意义。该研究以“Characterizing Intraindividual Podocyte Morphology In Vitro with Different Innovative Microscopic and Spectroscopic Techniques”为题发表于《Cells》。

足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，位于肾小球基底膜外侧。肾小球足细胞直接或间接的损伤会导致蛋白尿，甚至肾病综合征。尽管足细胞的形态学结构具有重要的临床意义，但由于缺乏形态学和化学特征的数据，这对了解足细胞损伤的基本机制和制定有效的治疗策略提出了重大挑战。

足细胞形态观测困局

要全面了解足细胞在损伤过程中的复杂形态和化学变化，必须结合使用互补的显微镜和光谱技术。然而，一直以来，令科学家感到费解的是，尽管经过多方尝试，也未能观测到足细胞损伤过程中形态变化的可靠数据。

Annalena Kraus 通过对足细胞进行了单细胞 RNA 测序（scRNAseq），回答了这个问题。scRNAseq 结果显示：足细胞在形态相关基因的表达上表现出高度的异质性，这也就意味着，即使在同一个细胞培养皿中，经过完全相同的条件培养，足细胞之间也会有所不同。

这就要求研究人员必须使用多种显微分析技术去观察同一颗细胞。因此，多设备之间对细胞的共定位就尤为重要。

不同的显微分析设备需要不同的细胞前处理过程。尽管 Annalena Kraus 可以摸索出一套可兼容多种分析设备的制样流程，但能在不同显微镜下找到同一颗细胞进行观察，无异于大海捞针。

HORIBA nanoGPS 跨平台共定位技术帮助了他，实现了在足细胞单细胞水平上的多种显微分析设备联用。

nanoGPS 实现五大设备联用

Annalena Kraus 使用 TGF-β 处理人足细胞制备足细胞损伤模型，并和对照组（未经处理的人足细胞）分别使用光学显微镜（LM）、拉曼光谱、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和扫描离子传导显微镜（SICM）对相同细胞进行连续分析。

「01. 光学显微镜」

使用 LM 生成整个载玻片（布满了足细胞）的全局图像，以便选择感兴趣的研究区域（ROI）进行后续显微分析。Annalena Kraus 从中选定了五颗未经处理的足细胞和五颗 TGF-β 处理的足细胞。

未经处理和 TGF-β 处理的人足细胞的 ROI 光学显微镜图像。（A）：三种不同放大倍率下未经处理的人足细胞的ROI明场图像。（B）：TGF-β 处理的人足细胞的 ROI 在三种不同放大倍率下的明场图像。

「02. 拉曼光谱仪」

nanoGPS 帮助在拉曼光谱仪上定位 ROI，以分析细胞的化学组成，结果发现除 813 cm^–1和 891 cm^–1两个峰外，TGF-β 处理的足细胞的拉曼信号强度低于未处理的足细胞。这表明 TGF-β 处理后，足细胞的膜结合磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺、胶原蛋白、酰胺Ⅲ/胞嘧啶/腺苷酸、鞘磷脂和脂肪酸含量显著降低。

未经处理（A）和 TGF-β 处理（B）的人足细胞的 ROI 的拉曼光谱图像。（C）：未经处理的人足细胞的平均拉曼谱图，以及特征峰的对应分子。未经处理（红色）和经 TGF-β 处理（蓝色）的人足细胞完整拉曼光谱（D）和<1800 cm⁻¹的拉曼光谱（E）。

*特征峰：磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺（~722, 760, 766 cm^–1）、苯丙氨酸（~1002 cm^–1）、磷脂（~1085 cm^–1）、胶原蛋白（~1259 cm^–1）、酰胺Ⅲ、胞嘧啶和腺嘌呤（~1303 cm^–1）、脂肪酸（~1447 cm^–1）、鞘脂簇（~1656 cm^–1）

「03. 扫描电子显微镜」

足突是足细胞行使功能的重要组织，它的初级足突逐渐延伸形成次级足突，并与相邻足细胞的次级足突连接形成狭缝隔膜，参与构成肾小球滤过屏障。分析足突这类超微结构需要使用高分辨率的 SEM。nanoGPS 准确定位到 LM 和拉曼光谱仪表征的 ROI，结果发现未经处理的足细胞平均有128个足突结构（平均长度为9.4 μm），而经过 TGF-β 处理的足细胞平均观测到89个足突结构（平均长度为3.88 μm）。可见，TGF-β 处理的足细胞足突结构不仅发育得更少，而且更短。

未经处理（A）和 TGF-β 处理（B）的人足细胞的 ROI 的 SEM 图像。（C）：未经处理和经 TGF-β 处理的人足细胞足突结构的长度定量分析。

「04. 原子力显微镜」

AFM 不仅可以佐证 SEM 的表征结果，还可以对细胞表面形貌进行成像，nanoGPS 帮助准确定位到 ROI。结果显示，TGF-β 刺激的足细胞的表面粗糙度显著降低（未经刺激的足细胞中位高度约4 μm，平均足突宽度约200 nm ，而 TGF-β 刺激的足细胞中位高度约2 μm），表明刺激后细胞表面更平整。

未经处理的人足细胞（A）和 TGF-β 处理的人足细胞（B）的 ROI 的 AFM 图像。（C）：未经处理（红色）和经 TGF-β 处理（蓝色）的人足细胞在细胞核水平的高度。未经处理（黑）和经 TGF-β 处理（灰）的人足细胞足突样结构宽度（D）和表面粗糙度定量（E）。

「05. 扫描离子传导显微镜」

使用 SICM 可以观察活的足细胞经过 TGF-β 处理后的动力学过程（且结果可以和同样可用以观测活细胞的 LM、拉曼光谱仪联合分析）。直接观测活细胞不仅可以排除细胞固定和干燥造成的干扰，还可以观察动态过程（如细胞间通讯、相互作用和接触）等。结果显示，TGF-β 处理后的足细胞表现出更低频率的细胞间接触，足突明显变宽。与固定细胞相比，活细胞的足突长度和宽度均增加。

未经处理（A）和 TGF-β 处理（B）的人足细胞的 ROI 的 SICE 图像。（C）：未经处理（黑）和经 TGF-β 处理（灰）的人足细胞足突长度的定量。（D）未经处理（黑）和经 TGF-β 处理（灰）的人足细胞足突宽度的定量。

上述结果表明，TGF – β 处理导致足细胞发生了显著的变化，包括形态的改变、细胞足突的回缩、细胞-细胞接触的丧失和分子组成的改变，以上都是科学家首次在同一细胞中观测到的。

使用 nanoGPS 单细胞多设备联用分析活细胞或固定细胞的顺序工作流程

关于 nanoGPS

在这项工作中，HORIBA nanoGPS 跨平台共定位技术，让单细胞水平上的多设备联用成为可能。nanoGPS 能用于多种显微技术对同一样品相同区域表征，该技术即可完成在不同显微技术上目标研究区域的重新定位，获得样品丰富的微区信息。

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