【飞诺美色谱】乳制品中L羟脯氨酸的测定方法学验证

--- 异硫氰酸苯酯(PITC)

摘要：本实验采用高效液相色谱 (HPLC) 法结合紫外检测器，使用Venusil ® AA氨基酸专用分析柱，以异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前衍生剂，运用外标法，对部分市售乳制品中L-羟脯氨酸进行测试。实验结果表明，在波长254 nm，流速为1.0 mL/min，以0.1mol/L醋酸钠缓冲液（pH=6.5）与80%乙腈为流动相进行梯度洗脱，L-羟脯氨酸线性范围为0.125-6.25mg/L，相关系数大于0.999，平均回收率在90-110%之间，平行样品的相对标准偏差小于5.0%，方法检出限为1.5mg/kg。本方法灵敏度高、重复性好，可用于乳制品中L-羟脯氨酸的检测。

关键词：高效液相色谱法；异硫氰酸苯酯(PITC)；L-羟脯氨酸；乳制品；Venusil ® AA 色谱柱

前言

皮革奶，是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品，加入到乳制品中的目的是提高产品蛋白含量。皮革水解蛋白本身对人体无害，但由于皮革水解蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，长期服用会导致重金属中毒。L-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特征性成份之一，而乳制品中的乳蛋白中不存在，故将L-羟脯氨酸的检测作为判定乳及乳制品中是否含有水解蛋白的依据。

本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生剂，使用Venusil ® AA氨基酸分析专用柱对5种市售乳制品中L-羟脯氨酸进行测试。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

Agilent 1100 高效液相色谱仪、Agela Technology 15 位干式电模块氮吹仪；

试剂材料

色谱柱：Venusil ® AA；5 μm；4.6 × 250 mm；

L-羟脯氨酸标准品：白色晶体，纯度≥98%；异硫氰酸苯酯：纯度≥99.0%；屈臣氏蒸馏水；乙腈为色谱纯；无水醋酸钠、苯酚、浓盐酸、冰醋酸均为分析纯；

水解液：6.0 mol/L 盐酸溶液(含 1%苯酚)；

稀盐酸：0.1 mol/L 盐酸；

三乙胺乙腈溶液：取三乙胺 1.4 mL，加乙腈 8.6 mL，混匀；

异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯 25 μL，加乙腈 2 mL，混匀；

0.1mol/L 醋酸钠缓冲液（Ph=6.5）：称取 8.23g 无水醋酸钠，加 1000mL 水溶解，冰醋酸调节 pH 至 6.5；

标准储备液 1000 μg/mL：准确称取 10 mg 标准品于 10 mL 容量瓶中，用 0.1 mol/L盐酸溶解并定容至刻度，即得；

标准工作液 100 μg/mL：用 0.1mol/L 盐酸稀释标准储备液至 100 μg/mL。

样品水解

准确称取样品 1 g(奶粉样品称取 0.2 g)，置于 12 mL 水解管中，加入 8 mL 水解液，振摇使样品均匀分散于溶液中，然后将水解管置 110℃烘箱中水解 24 小时，取出冷却，打开水解管，将水解液全部转移至 20 mL 玻璃试管中,用 0.1moL/L 盐酸定容到刻度，混匀，过滤，取滤液，作为衍生用样品溶液。

样品衍生

准确量取衍生用样品溶液 1.0 mL，置一玻璃管中，用氮吹仪于 50℃下氮吹至干，残渣加 1.0 mL 稀盐酸复溶，混匀，量取 200 μL 水解后样品溶液于 5 mL 玻璃试管中，依次加入 100 μL 三乙胺乙腈溶液，100 μL 异硫氰酸苯酯乙腈溶液，摇匀，于室温下放置 1 h，然后加入正己烷 800 μL，振摇后放置 10 分钟，取下层溶液，用 0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液 200 μL，加水 800 μL 稀释后上机测试。

L- 羟脯氨酸标准曲线的绘制

用 L-羟脯氨酸标准工作液分别配成 0.125、0.25、1.25、2.5、6.25 μg/mL 的标准系列溶液，采用上述衍生方法，使用外标法定量，绘制标准曲线。

色谱条件

色谱柱：Venusil ® AA；5 μm；4.6 × 250 mm；

流 速：1.0 mL/min；

柱 温：40 ℃；

波 长：254 nm；

进样量：20 μL；

流动相 A：0.1 mol/L 醋酸钠缓冲液(冰醋酸调节 pH=6.5) ︰ 乙腈=1000 ︰ 75；

流动相 B：乙腈 ︰ 水=80 ︰ 20；

梯 度：

结果与讨论

方法学考察

标准曲线及检出限

按照上述色谱条件，分别对 L-羟脯氨酸系列标准溶液进样测试，L-羟脯氨酸在浓度 0.125-6.25mg/L 范围内有线性关系良好，回归方程为 y = 12.607x + 0.5205，相关系数为 0.9999，检出限（S/N=3）为 1.5 mg/kg。

方法的精密度与回收率

精密度实验

在上述色谱条件下，使用 1.25 μg/mL 标准溶液连续进样 6 次对仪器精密度进行测试，表明方法重现性好，结果见下表 2。

市售乳制品检测及加标回收实验

按上述的处理方法，对 5 种市售乳制品(牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶) 分别进行加标实验，并计算回收率，加标浓度及回收率结果见表 3，L-羟脯氨酸的加标平均回收率在 90-110%之间，相对标准偏差小于 5%，该方法的回收率好。

结论

根据实验结果，采用 Venusil ® AA 氨基酸分析专用柱，以异硫氰酸苯酯（PITC）为衍生试剂测试乳制品中的 L-羟脯氨酸，方法灵敏度高、重现性好，可用于判定乳制品中是否添加皮革水解蛋白。

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