概述:
布洛芬是一种非类固醇类消炎药 (NSAID),可用来缓解骨关节炎或
类风湿性关节炎的症状,也可用于缓解头痛,牙痛,关节疼痛和背痛等
疼痛。布洛芬有多种制剂可供选择,如片剂,胶囊,咀嚼片以及口服溶
液。在本技术笔记中,我们展示了一种对于布洛芬片溶出度检测的替
代方法。与美国药典 (USP) 中关于布洛芬片溶出度检测推荐的UV检
测方法不同,这种快速的 HPLC 替代方法可以在较短的时间内得到更
好的峰形。通过对两支不同规格但符合USP允许调整范围要求 (USP
通则 <621>)的L1 色谱柱进行对比。进行溶出度检测,整体分析时间
小于 2 分钟,并且峰形可以和标液进样媲美。色谱柱的上样量也通过
不同的进样体积进行了研究。
材料
溶出度测定法
布洛芬标样及所用试剂购于 Sigma-Aldrich。
布洛芬片采购于当地药店。
实验条件:
溶出度测定法
溶出剂的制备基于美国药典 (USP) 中关于布洛芬片溶出度检测的相
关方法。 600 mg 布洛芬片溶解于 pH 7.2 的磷酸盐缓冲介质中。关于
溶出介质的制备,将 6.89 g 的磷酸二氢钠单水合物(NaH2PO4 分子
量 137.99)加入 800 mL 纯水中,然后用 50% NaOH 调节 pH 到
7.2 。最后定容到 1000 mL。
仪器装置:篮法, 50 RPM, 900mL
时间点: 60 min 单个时间点
样品通过 0.45 µm RC滤膜的针式过滤器进行过滤(针式过滤器货
号:AF0-2103-52, 塑料一次性注射器货号:AS0-8409)
标准溶液:50 µg/mL 溶解于溶出介质
流动相制备
流动相按照布洛芬片 USP 相关方法进行制备,将 4.0 g 氯乙酸溶于 400 mL 纯水中,并通过氢氧化铵将其调节到 pH 3.0 ,之后再与 600
mL乙腈混匀。
表1:
两支不同规格色谱柱上布洛芬片溶出度检测的 USP 拖尾因子、峰高以及柱效
图 1:
标样与溶出样品的色谱图对比
图 2:
色谱柱上样量测试
图 3:
标样与溶出样品的色谱图对比
图 4:
色谱柱上样量测试
结果与讨论
图 1 显示的是布洛芬标准溶液和溶出样品的对比图。该图使用的色谱
柱为 Kinetex C18 5 µm 150 X 4.6 mm,流速为 2.0 mL/min,进样量
5 µL。可以看出,溶出样品的保留时间和峰形都与布洛芬标准溶液类似。
为了测试色谱柱的上样量,我们在该色谱柱上尝试了不同的进样量 (
如图 2 所示)。随着进样量的增大,分析物的峰高逐渐增大,杂质的峰
高也随之增大。但是,杂质峰与主峰之间的分离度很好。因此,增大进
样量并不会对布洛芬溶出样品的定量分析造成困扰。
表 1 展示了两支不同规格 Kinetex 色谱柱的USP拖尾因子、峰高以及
柱效。可以看出,随着上样量的增大, USP 拖尾因子也随之增大。当进
样量为 5 µL 时,拖尾因子 1.122; 当进样量上升到 50 µ L时,拖尾因子
增加到了 1.395。 USP 系统适应性测试要求对于布洛芬片,拖尾因子
不应超过 2.5(NMT 2.5)。不同进样量溶出样品的拖尾因子完全符合
方法要求。并且,色谱峰的响应强度也使得准确定量溶出样品中的布
洛芬含量成为可能。当需要检测低含量、缓释片剂,或者比较短的溶出
时间点时,就需要较大的进样量来保证足够的峰强度以进行定量。本
实验中验证的不同进样量显示,即使达到 50 µL 的进样量,色谱峰的
峰形和强度依旧保持良好。
USP通则 <621> 允许等度方法对色谱柱规格以及粒径大小进行调
整。只需要保证色谱柱长度 (L) 和粒径 (dp) 的比值 (L/dp) 在
-25% 到 +50% 之间,我们就可以通过使用较小的粒径以及不同长度的色谱
柱来获得更佳的分离效果。第一支色谱柱 (Kinetex 5 µm C18 150 x
4.6mm) 的 L/dp 为 30,000 v Kinetex 2.6 µm C18 75 x 4.6mm) 的 L/
dp 为 28,864。可以看出,该调整在 USP 通则 <621> 允许的范围内。
图 3 和图 4 为使用第二支色谱柱 (Kinetex 2.6 µm C18 75 x 4.6mm)
所获得的色谱图。所使用的样品与第一支色谱柱 Kinetex 5 µm C18
150 x 4.6mm 相同(见图 1 与图 2 )。由于使用了较小的粒径,色谱柱
的背压会明显升高,因此我们将流速降低到 1.8 mL/min 来减小背压
以使其仍在 HPLC 系统的背压范围内。根据 USP 通则 <621> 的规
定,等度方法的流速可以在 ± 50% ( 范围内进行调整。虽然该色谱柱
75 x 4.6 mm) 只有前一支 (150 x 4.6 mm) 一半长度,但其柱效(塔
板数/米)却因为使用了较小的粒径 (2.6 µm) 而增大。因此,在使用该
色谱柱时,可以观察到峰强度明显增加,并且峰宽变窄。使用较小粒径
的色谱柱可以缩短分析时间,但是,即使减小流速,2.6 µm 粒径色谱
柱的背压 (约 220 bar) 也会比 5 µm 粒径色谱柱的背压 (约 170 bar)
明显增大。如果 HPLC 系统对于压力的限制不大,那么使用 Kinetex
2.6 µm 色谱柱对于缩短分析时间大有裨益。可以看到,使用 2.6 µm
较短色谱柱可以将布洛芬的保留时间缩短 50%。
结论
在此关于布洛芬片的 USP 溶出度检测中,布洛芬的溶出含量可以通
过 HPLC-UV 色谱法进行检出。溶出样品和标准溶液都与传统 UV 吸
收检测法进行了对比。可以看出,通过采用 HPLC 色谱检测法,色谱峰
的强度足以对溶出样品中的布洛芬进行准确定量,并且整个分析时间
少于 2 分钟。本实验使用了两支符合USP通则 <621> 调整要求的不
同规格Kinetex 色谱柱进行分析。该溶出度检测方法针对中国生物等
效性 (BE) 市场进行调整的。该方法显示出一种与传统 UV 检测不同
的新的 HPLC 色谱分析法。
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