【飞诺美色谱】GalNAc L96的液相色谱分析方法

艾杰尔飞诺美

2024/09/05 18:29

概述

GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联修饰是当前最常用的小核酸药物递送系统。将GalNAc以三价态的方式共价缀合到不同序列的siRNA的正义链3′末端，形成多糖-siRNA单缀合物，从而实现向肝细胞的特异性递送，并通过细胞内吞作用使药物进入细胞发挥功能。

GalNAc是唾液酸受体（ASGPR）的靶向性配体，其与肝脏表面细胞具有较高的亲和力和迅速内化能力。GalNAc与肝细胞表面的ASGPR结合后进入细胞内形成内涵体，从而将足够数量的siRNA带入细胞内。

目前已上市的4款GalNAc-siRNA偶联物均使用L96作为载体，结构均由3部分组成，分别为三触GalNAc靶头、连接臂以及siRNA分子。GalNAc以三触形态共价偶联到siRNA的正义链3’末端，形成GalNAc-siRNA偶联物。

作为一种核酸药的起始物料，我们需要对其纯度进行检测，通常会采用RP-HPLC的方法。本文开发了一种液相分析条件，可以用于GalNAc L96的液相纯度检测和以及质谱杂质鉴定。

关键词

GalNAc L96； RP-HPLC；有机硅胶杂化色谱柱；Gemini NX-C18

化合物信息

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Waters H-Class 超高效液相色谱仪

3.1.2试剂材料

实验用水、乙腈、氨水均为色谱级。

3.1.3样品

精密称取1.0mg样品，加入1mL的50%乙腈稀释。

3.2色谱条件

色谱柱： Gemini NX-C18（4.6×150mm, 3.0μm, 110Å）；P/N: 00F-4453-E0

流动相A相：0.1%(v/v)氨水；

流动相B相：0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液；

流速：0.6 mL/min；

柱温：25 ℃；

波长：210nm；

进样量：5 μL；

梯度程序见表2：

3.3结果与讨论

3.3.1 色谱条件和色谱柱的选择

本实验对比了磷酸，磷酸盐缓冲液，三乙胺和氨水等不同的流动相添加剂，发现选择氨水作为流动相添加剂时，峰的对称性，基线干扰，响应和杂质分离等方面优于其他条件。因此选择0.1%氨水作为流动相添加剂。

在选择氨水作为流动相添加剂，流动相的pH在10左右，如果选择纯硅胶基质的色谱柱其寿命和重现性会有问题。因此本文选择了飞诺美的Gemini NX系列有机杂化硅胶色谱柱。这种杂化硅胶技术可以在硅球的表面形成高度稳定的乙基交联结构，从而可以抵抗高pH的侵蚀，并且有更高的机械强度，同时保留了硅胶的高效分离能力。

3.3.2 峰型和分离度

取1.0mg/mL的GalNAc L96的溶液5uL上样，得到的峰型尖锐，塔板数106734，对称因子为0.86。主峰前杂和主峰基线分离，按照面积归一化法计，GalNAc L96的纯度约为94.95%，而根据试剂供应商的检测报告，样品的纯度大于98%。

结论

本应用使用了Gemini NX-C18色谱柱对GalNAc L96的纯度进行液相分析。因为使用碱性的流动相条件，而常规的硅胶基质色谱柱不耐碱，聚合物基质的色谱柱虽然能耐受宽的pH，但是分离效能低下，所以本文选用了Phenomenex Gemini NX-C18色谱柱。

这种有机硅胶杂化工艺的色谱柱在硅球的表面形成高度稳定的乙基交联结构，从而可以抵抗碱性流动相对硅氧键的侵蚀，并且有更高的机械强度，同时保留了硅胶的高效分离能力。

在该应用中，能够有效的分离主峰附近的杂质，主峰的峰型对称且尖锐。氨水作为流动相添加剂，使得方法满足于紫外，CAD，质谱等检测器的需求，满足实际分析中的应用要求。

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