一、概述
水溶性维生素及其代谢产物作为辅酶参与人体细胞 代谢，以防止代谢紊乱。同时水溶性维生素也参与体内 各项能量代谢，例如磷酸化形式的硫胺素(Thiamine)在 三羧酸循环中起着关键作用，核黄素(Riboflavin)、烟酸(Nicotinic acid) 、 泛 酸 (Pantothenic acid) 、 吡 哆 醛 (Pyridoxal)、叶酸(Folic acid)参与氧化、还原反应，脂肪 酸和神经递质合成以及碳代谢等。水溶性维生素的缺乏 会影响人体正常生理功能，因此临床亟待开发同时检测 多种水溶性维生素方案并应用临床诊断。
目前，水溶性维生素在血浆中的检测仍存在诸多难 点，如检测灵敏度差、提取回收率低、不稳定和基质干 扰严重等。因此，建立一种高通量、广覆盖、快速的分 析方法实现血浆中多种水溶性维生素具有重要意义。
关键词
水溶性维生素及其代谢物；Cleanert PPT；Luna Omega Polar C18；LC-MS/MS
二、化合物信息
三、实验部分
3.1 仪器、试剂与材料
3.1.1 主要仪器设备
液相色谱串联质谱仪(AB SCIEX Triple QuadTM4500)，配有电喷雾离子源(ESI)；
96孔正压装置(Agela Cleanert M96)；
3.1.2 试剂材料
96孔板： Cleanert PPT，2 mL/well；P/N： 96CD2025-Q
屈臣氏蒸馏水，甲醇、甲酸、乙腈均为色谱 级。
3.1.3 样品基质
PBS缓冲液，人血浆。
3.2 样品前处理方法
将Cleanert PPT与收集板放置在一起；
在PPT板中加入3倍样品体积的沉淀剂（300μL含 抗氧化剂的甲醇）；
加入100μL血浆样本（含有10μL内标溶液）；
使用移液器反复吹打充分混匀样品，沉淀蛋 白；
正压收集滤液；
将收集板内液体氮吹干后，加入50μL万分之一甲酸水复溶，待LC-MS/MS分析
3.3 质谱条件
离子源类型：电喷雾离子源（ESI）
扫描方式：多反应监测正负离子模式（MRM）
喷雾针电压：5500 V/-4500V
离子源温度：450 ℃
加热器（GS1）：35 psi
辅助加热气（GS2）：50 psi
气帘气（CUR）：30 psi
碰撞气（CAD）：8
为获得较好的稳定和灵敏度，各化合物监测离子对的去簇电压（DP）和碰撞电压（CE），目 标化合物定量离子对以及内标监测离子对等参 数均需经过系统优化。本案例参数仅供参考不 具备法律效力。
表2. 化合物定性、定量离子和质谱分析参数
3.4 色谱条件
色谱柱： Luna Omega Polar C18（2.1×100 mm, 3 μm）；P/N: 00D-4760-AN
流动相A相：0.1%甲酸水溶液；
流动相B相：0.1%甲酸乙腈溶液；
流 速：0.4 mL/min；
柱 温：40 ℃；
进样量：3 μL；
梯度程序见表3：
3.5 结果与讨论
3.5.1 灵敏度和线性
由于血浆和BSA基质均存在本底，因此该方法以PBS为替代基质配制混合标曲溶液，按照上述3.2操 作步骤进行处理，制得标准工作曲线，如表3所示， 14种水溶性维生素及其代谢物的线性范围均可做到0.5ng/mL ~ 100 ng/mL，且良好的线性，R 2≥0.995。
3.5.2 人血浆样本分析
实验后期采用人空白血浆样本和5ng/mL人血浆加 标样本进行方法验证，考察检出限和基质干扰分离情况， 如图2所示，在人血样本中，14种化合物与基质干扰物 均可以分离，对人血浆样本中水溶性维生素及其代谢物 能够准确定性。考虑到血浆与PBS基质效应差异，建议 购买相应内标采用内标法去校准定量，本实验均外标法。
3.6 实验谱图
结论
本方案经过对多款色谱柱的筛选比对，采用Luna Omega Polar C18建立了一种对血浆中14种水溶性维生素及其代谢物含量测定的LC-MS/MS方法。该方法使用 Cleanert PPT蛋白沉淀板，对样本进行简单便捷的处理 后上机测试；流动相中采用酸化水和酸化乙腈，无需加 盐的方式，提高了正模式下化合物的灵敏度的同时，在 8 min内也实现了同时检测14种水溶性维生素及其代谢 物且对基质干扰物的分离，方法具有高通量、高灵敏度 的特点。该方案可为临床相关疾病辅助诊断提供精准水 溶性维生素的浓度水平信息。
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