【飞诺美色谱】体积排阻色谱法分析Cas9 IVT mRNA聚集体

概述

2023 年 4 月，USP 重磅更新了新的一版《mRNA 疫苗质量分析方法-指南草案》，该草案从整个 mRNA 疫苗产品的全生命周期出发，涵盖质粒 DNA、 mRNA 药物原料、mRNA 药物制剂的表征、质量放行 以及在开发和生产过程中应用的标准操作流程。

mRNA是一种单链RNA分子，可以形成二级结构 （如发夹和R-环）和三级结构，并可能与其他mRNA 分子发生相互作用从而形成聚集。而聚集体的存在 可能会影响mRNA的稳定性、活性。因此，在USP草 案中收录了SEC-HPLC方法用于mRNA聚集体的定量 测定方法。

本应用采用Phenomenex全新推出的700A大孔的 Biozen dSEC-7色谱柱对全长约为4.5K nt的Cas9 IVT mRNA以及其聚集体进行分离并定量。并对比了不同 的流动相条件和流速等参数，旨在对基于该色谱柱 的mRNA聚集体分离SEC方法开发做出参考。

关键词

Cas9 IVT mRNA；dSEC-7；SEC-HPLC；聚集体

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪

3.1.2试剂材料

无水磷酸三钠、磷酸、Tris-盐酸盐、氨水、乙 酸铵、氯化铵、氯化钠、超纯水；

3.1.3样品

Cas9 IVT mRNA（4486 nt），浓度为2118.921 ng/μL，用无酶水稀释20倍后上样;

*特别感谢云舟生物科技（广州）股份有限公司提供此次样品，云 舟生物作为全球基因递送技术的创新型企业，提供基因递送方案的 设计研发与优化，科研用载体定制（包括基因载体构建、质粒DNA 制备、病毒包装、CRISPR/shRNA文库构建、稳转细胞株构建、 mRNA体外转录、重组蛋白表达纯化等）全产业链服务。以其优异 的产品和服务，为科研工作者以及相关企业提供了宝贵的支持。

3.2色谱条件

色谱柱：Biozen dSEC-7（4.6×300 mm, 3 μm, 700Å）；P/N: 00H-4789-E0

流动相：如下表所示

流 速：参见实验结果

柱 温：30℃；

波 长：260 nm；

上样量：4 μL

梯度方法：等度

3.3结果与讨论

3.3.1不同流速对分离的影响

我们优先选择按照USP收录的流动相（参见表1 流动相条件1）重现，并对比了不同流速下的分离度 和聚集体百分含量，具体结果参见表2。尽管从色谱 柱耐压的角度来说，dSEC-7可以耐受很高的流速， 从而极大缩短分析时间，提升实验通量。但是从分 离度的角度来说，降低流速有利于更好的分离（参 见图1）。所以我们在选择流速的时候，需要同时结 合分析目的一起考虑。如果是需要进行高通量的筛 选，我们建议可以采用0.3-0.5 mL/min的高流速；如 果考虑聚集体分离和定量的需求为主，我们建议可 以采用相对较低的流速，例如0.2-0.25 mL/min。

3.3.2 不同流动相对分离的影响

基于上述USP流动相的条件，我们进一步对比更 高离子强度的流动相（参见流动相条件2），以及反 之降低缓冲溶液的浓度（参见流动相条件3）对于分 离的影响。在相同的流速下（0.30 mL/min），我们 可以发现，增加氯化钠的浓度（参见图2红色曲线） Cas9 IVT mRNA的保留时间会有所延延迟，同时聚集 体的分离度 和百分含量进一步提高；反之降低流动 相的离子强度（参见图2蓝色曲线）对于分离的变化 则相反。尽管上述实验结果表面提高流动相的离子 强度对于分离可能会有一定的改善，但是考虑到高 盐流动相会对mRNA分子有潜在的影响，所以我们没 有用更高的浓度进行对比。

表3. 不同流动相结果比较

而另一种对于核酸类样品常用的SEC流动相体系， 即Tris-Hcl的缓冲体系（参见流动相条件4-6）的分离 结果和磷酸盐缓冲液的结果则存在比较大的差异。 在做SEC方法开发的时候，通常会在缓冲液中加入一 定浓度的盐来抑制样品和色谱柱的次级作用。首先， 我们对比了添加不同浓度乙酸铵对于分离的影响。 总体来说，分离度明显没有磷酸盐缓冲液的分离好， 可能也间接造成聚集体百分比的差异。在缓冲液中 添加乙酸铵的浓度增加时，峰面积响应出现了整体 的降低，聚集体的分离度也没有明显改善，反而聚 集体的百分含量有所下降。（参见图3）可见乙酸铵 对于Cas9 IVT mRNA聚集体的分析来说，并不是一个 很好的分离改良剂。

除了添加乙酸铵以外，我们还对比了添加另外 两种盐的效果，分别是最常见于SEC流动相中的氯化 钠，和氯化铵；添加的浓度为250 mM。图4中对比 了四种不同流动相条件的结果，参与对比的几种流 动相的总离子强度都在250 - 300 mM。可以明显的 发现，除了流动相条件6（蓝色曲线）的分离度和聚 集体百分含量比较低，其余几种流动相条件下对于 Cas9 IVT mRNA的分离度接近，而添加氯化钠的流动 相体系的聚集体百分含量最高。

综上所述，用该色谱柱进行mRNA聚集体分析的 流动相方法开发的时候，建议可以从USP推荐的流动 相浓度开始摸索，也可以结合Tris缓冲盐的体系评 估，最终摸索到最佳的分析条件。

结论

SEC体积排阻色谱法是一种对于蛋白和核酸聚集 体分离度强大且稳健的分析技术，随着新型分子的 体积越来越大，近年来，SEC柱的孔径已经步入超大 孔的时代。飞诺美Biozen dSEC-7是一款硅胶基质的 700A大孔的SEC柱，通过上述实验证明该色谱柱可以 用于对大小约5000 nt 的IVT mRNA样品聚集体的分离 能力。Biozen dSEC-7还采用了BioTiTM生物惰性硬件， 进一步降低了和生物大分子之间的次级相互作用， 提高了产品的稳定性，极少量的样品即可获得足够 的聚集体响应。实验结果表面，该色谱柱适合用于 mRNA聚集体的质量研究和放行检测。

另外，SEC方法作为一种Native的分析方法，可 以模拟出mRNA分子在不同的formulation中的原始状 态，辅助用于formulation的筛选工作。