一、概述
IGF（Insulin-like Growth Factor，类胰岛素生长 因子）主要分为IGF-1和IGF-2，它们是一类与胰岛素 具有相似结构和生物学功能，分子量约 7500~7700kDa的蛋白质激素。IGF是由身体内的肝脏 和其他组织合成和分泌的，通常通过与细胞表面的 IGF受体结合，触发一系列的细胞信号传导路径，从 而影响细胞的生长、分化、代谢和存活等生物学过 程。IGF的异常水平与生长激素缺乏、肥胖、糖尿 病、癌症等多种疾病的发生和进展相关，因此，通 过准确测定血浆中的IGF水平，可以为疾病的诊断、 监测和预后评估提供可靠的指标，促进个体化医疗 的实施，并推动相关领域的研究和药物开发。
关键词
IGF；PAX；Kinetex C18；LC-MS/MS
二、实验部分
2.1仪器、试剂与材料
2.1.1主要仪器设备
液相色谱串联质谱仪(AB SCIEX Triple QuadTM4500)，配有电喷雾离子源(ESI)； 96孔正压装置(Agela Cleanert M96)；
2.1.2试剂材料
96孔板：Cleanert PAX（10mg/1mL/Well, 2ea/pk），P/N：AX0101
屈臣氏蒸馏水，甲醇、乙腈、甲酸、氨水均为 色谱级；CHAPS。
2.1.3 标准品
IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ，由客户提供。
2.1.4样品基质
PBS缓冲液替代基质
自购商品化大鼠血浆
2.2样品前处理方法
预处理：100 µL血浆，加入10 µL内标溶液后， 加入20 µL 1%Chaps溶液，混匀后于37℃孵育 30min，随后加入200 µL甲醇（含5%乙酸）混匀 1min，再加入5%氨水500 µL，混匀在15000rpm 离心5min，取上清800 µL待净化；
活化：96孔板依次使用 200 µL甲醇、200 µL5% 氨水活化；
上样：加载预处理后的血浆至活化后微孔板；
淋洗：分别使用400 µL水、400 µL5%甲醇淋洗；
洗脱：用50 µL洗脱液（甲醇：水：乙酸 =70:20：10）洗脱2次；
稀释：加入100uL纯水稀释，混合后上机测试。
2.3仪器检测条件
2.3.1色谱条件
色谱柱：Kinetex C18（3×50 mm, 2.6 μm）；
P/N: 00B-4462-Y0
流动相A相：0.1%甲酸水溶液；
流动相B相：0.1%甲酸乙腈溶液；
流 速：0.7 mL/min；
柱 温：50 ℃；
进样量：20μL；
梯度程序见表2：
2.3.2质谱条件
离子源类型：电喷雾离子源（ESI+）
扫描方式：多反应监测正负离子模式（MRM）
喷雾针电压：5500 V
离子源温度：550 ℃
加热器（GS1）：35 psi
辅助加热气（GS2）：70 psi
气帘气（CUR）：30 psi
碰撞气（CAD）：10
为获得较好的稳定和灵敏度，各化合物监测离 子对的去簇电压（DP）和碰撞电压（CE），目 标化合物定量离子对以及内标监测离子对等参 数均需经过系统优化。本案例参数仅供参考不 具备法律效力。
2.4 结果与讨论
2.4.1 灵敏度和线性
实验以PBS为替代基质采用PAX混合阴离子交换 前处理方式制得标准曲线见图1。该方法线性范围为 5ng/mL ~ 500ng/mL，线性良好，R 2均大于0.990。对 大鼠血浆进行最低检出限5ng/mL加标实验，商品化 大鼠血浆中IGF-1本底含量较高，IGF-2无本底能够满 足检出限测试要求（见图4）。本实验为外标法，考 虑到人血浆基质效应的差异，准确定量仍需要选择 对应的合适的内标去进行校正。
2.4.2 前处理耗材对化合物的吸附性
实验过程中也对前处理耗材做了一定的吸附对 比实验，见表4，同时将50ng/mL标准溶液配制到不 同前处理耗材中，发现Agela 96孔收集板所得到的化 合物的响应最高吸附性最小，其他的离心管对化合 物的吸附作用较强。该化合物分子量较大，属于蛋 白类激素，存在比较强的特异性吸附作用。因此整 个实验过程需注意采用低吸附耗材，且标准品加入 一定量的乙酸能够一定程度减少吸附作用。
3.5实验谱图
三、结论
本实验建立了一种血浆中IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的完整 定量方法，利用Chaps孵育阻断与受体蛋白结合，蛋 白沉淀后采用Cleanert PAX混合型阴离子交换的方式 对样本溶液净化和富集，LCMSMS定性定量。该方法 线性良好，最低检出限5ng/mL。
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