01、上十几万分子量的蛋白如膜受体,质谱成像用 AP/MALDI 是否可以做?
对蛋白质大分子,AP/MALDI 与真空 MALDI 在切片预处理与离子化机理上是一致的。真空 MALDI 一般连接的是 TOF 或 TOF-TOF,质量范围可覆盖到十几万 Da。
AP/MALDI 后端若连接 QTOF 等高分辨质谱,单独以 TOF 功能采集,质量范围同样可以达到 TOF 分析器的质量扫描上限(如上万)。若连接的是 Orbitrap 等高分辨质谱,质量范围或受 Orbi 的扫描范围局限(可选用 EMR 或 UHMR 型号,上万)。若连接的是 QQQ 串联四极杆质谱,质量范围一般在数千。
对大蛋白分子,可首先喷涂蛋白酶,将蛋白质降解成肽段,再通过 AP/MALDI 分析肽段,即,以 Bottom-Up 的方式,适应后端质谱仪的质量范围特征。即,AP/MALDI 成像功能不受限。
02、MSI 质谱成像定量准确性如何?可以用内标定量吗?
质谱成像可通过同位素内标的归一化准确反映目标化合物在切片表面的定量信息。可先配制高低不同浓度的标准品溶液,并在空白对照切片(control section)上手动点涂,待标品液斑干燥后,将同位素内标加入基质,一起喷涂(手动、或以喷涂仪自动)在切片上;扫描后将标品液斑区域(ROI)内的信号强度经同位素内标归一化,建立标准曲线;然后扫描样品切片(sample section),得到扫描区域(ROI)经内标归一化后的信号强度,最后按标准曲线计算出对应的浓度。(相关方法文献可留言索取。)
对于后端质谱类型(或 QTOF、或 Orbi、或 QQQ),定量的线性范围略有不同,但都比真空 MALDI-TOF 等成像的线性范围宽。定量质谱如 QQQ 更具有高灵敏度、高重现性和浓度线性范围宽的优势。
小鼠脑中神经肽成像
03、AP/MALDI 的 CCD 镜头和激光光斑的位置是可调的,是否表示这些位置需要经常调节?
04、为什么 CCD 的图像在靶板上很清晰,但换成导电玻片就变模糊了?
05、正离子模式优化的参数可以套用在负离子模式上吗?
06、AP/MALDI 的信号响应与仪器的参数设置有什么关联,如激光能量、移动速度、激光频率、毛细管温度、靶板电压、自动增益控制(AGC)、离子注入时间等?
07、AP/MALDI 激光器的寿命如何?
08、在用 AP/MALDI 进行生物组织成像时,样品需进行哪些必要的处理?
一般流程是先做冷冻切片(不要使用石蜡或 OCT 包埋,可使用水或 PBS 缓冲液包埋),切好后(切片厚度建议10微米左右)转移至导电玻片,再经真空干燥除水(一般5至45分钟,视样品而定)。然后将切片先后在70%和96%的色谱纯乙醇中浸泡15至30秒,以去除表面的脂质和盐;如果检测对象是脂质和药物等小分子,切勿做清洗。清洗过的切片需再次经真空干燥,最后由喷涂仪将基质均匀喷涂在切片上。
神经酰胺在皮肤角质层和毛囊渗透性成像
09、AP/MALDI 如何选择基质?
若要参考真空 MALDI,一般而言,对脂质常用 DHB,对多肽常用 CHCA,对蛋白常用 SA 或 DHAP。
10、对分子量在100-300之间的药物小分子,除 CHCA 外,有什么基质推荐?
如果以分析负离子为主,可使用有机碱类的基质,如9-AA、DMAN 等。
500以下的药物小分子,除 CHCA,还可使用 DHB、sDHB(2,5-DHB 与5-甲氧基水杨酸的混合物)、9-AA 等。
11、基质喷涂的均匀程度是否影响检测?AP/MALDI 成像需要的基质层厚度是多少?
与其谈论厚度,其实更应该考虑基质结晶颗粒度。300纳米以下的基质结晶颗粒,有助于样品分子的均匀分布和保障成像灵敏度和几微米的空间分辨率。此话题另文展开讨论。
12、使用 AP/MALDI,一般需要调节优化哪些参数?
13、AP/MALDI 兼容的质谱品牌有哪些?
14、质谱的工作站能识别 AP/MALDI 源吗?
15、质谱成像数据用什么软件处理?
16、AP/MALDI 和 Sub AP/MALDI 的优势分别在哪里?
第二,相比于真空 MALDI,大气压 AP/MALDI 无论是连接高分辨质谱,还是串接质谱,都能充分利用这些质谱在分辨率/灵敏度上的优势而得到高质量的数据。
Sub AP/MALDI 工作在亚大气压,离子传输效率更高,更有利于蛋白等大分子的检测。灵敏度针对大分子通常高出20-100倍,对小分子的优势有限。该型号目前只能偶联有限的几款质谱型号。
编辑丨ASPEC 技术团队
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