01、在使用 TriVersa NanoMate 时,是结合纳升液相的场景多,还是单用的多?
三合一功能中:
(1)纳喷注射、
(2)馏分收集、
(3)在线纳喷源
三者中:只有(3),在利用75微米 ID 纳升柱,进行复杂肽段 Bottom-Up 类(临床)蛋白质组学研究时,才把 TVNM 当成在线离子源使用(用途之一),这时,偶联纳升液相 nanoLC。TVNM 在线保障全水和全有机相流动相梯度的全兼容(纳喷电场强度高),并能实时检测纳喷电流,保障喷雾连贯不中断。若遇到喷口堵塞,机器会自动于3 秒内移换喷针(共400个)。
另外两项功能,都不需要 nanoLC。即(1)纳喷注射,对抗体、非共、Histone、Intact Protein、PTM、Glyco,Metabolomics、Lipidomics、Shotgun、ADCs等的组学研究、药物发现、临床标志物表征、和蛋白科学等,都可直接纳喷注射。特点是喷雾非常稳定!一针一样,任何管路不需要冲洗。零残留!
(2)馏分收集及在线纳喷检测,只需要常规色谱柱(如 2.1毫米或300微米色谱柱等),分流 99.8% 以上,每隔 20 秒收集,另外 0.2% 在线用纳喷喷针自动喷雾监测信号。后续再回来注射某个 20 秒内的 1 微升馏分,累积信号寻找低丰代谢物或肽。此功能为代谢组学必备!
若升级为五合一功能:
(4)LESA 表面成像或药物轮廓分析:不需要 nanoLC。仅1μL 萃取表面,轮廓分析药物分布。成像空间分辨率 ~700 微米。
(5)LESA Plus 复杂组学分析:LESA 萃取后面再分离,可以用六通阀及微升或纳升色谱分离一下,便于除盐和增加复杂提取成分的细节分析,既可用于复杂的多组学分析,又可成像,空间分辨率 20~400 微米。
总之,若非沿用核心蛋白质组学流程(75微米纳升柱方法),而是着重于代谢组学、脂质组学、全蛋白质分析、组蛋白分析、抗体、ADCs、PTM 等,则完全可以单用 TVNM 和 LESA,不需要前面偶联液相。
02、TriVersa NanoMate 的重现性如何,线性范围是多少?一般最低检测限可以达到多少?
纳喷注射的检出限约 ~100 fg/μL,即若纳喷1微升,0.1 fg(小分子)或 0.1 amol(大分子)绝对量。
若使用 MCA 等信号累加(只有 TVNM 能在持续稳定喷雾的同时进行信号累加),则信噪比更呈根号 n 倍提升,对低丰度代谢物和多肽蛋白等有特效。
03、TriVersa NanoMate 做脂质有什么优势?主要应用在哪些方面?
纳喷的离子化效率远高于电喷雾,对脂质的离子化效果更好;不使用色谱柱的鸟枪法进样(Shotgun)避免了液质常见的脂质在柱上的残留导致的交叉污染;无需使用 LiOH 等碱性修饰剂,避免了常规纳喷毛细管柱和喷头的堵塞;无色谱且自动化进样能够实现大队列样品的高通量分析。
样品盘,可以降温至约4-5℃,保持样本的新鲜度,避免分解。唯一具备此独特功能的离子源。
TriVersa NanoMate 主要应用于多组学(包括微生物、代谢,脂质,蛋白,石油),抗体,ADCs,合成生物学,蛋白相互作用,药物分布成像,临床研究,反应监测,植物次生代谢研究,微生物科学,食药临检,卫生防疫等领域。
04、TVNM 有分离的功能吗?
质谱本身的分离功能无与伦比,色谱难以企及。只要分子能被离子化,进入质谱系统,分子离子的分离就极其容易实现了,比如利用高分辨质谱或利用 MRM 多反应监测。前提是,分子能被电离。ESI 电喷雾的特长明显,但短板同样严重,如普通电喷雾的离子抑制和竞争效应明显,造成多种类和各种极性的分子不易同时、平均、和等摩尔浓度地被电离和被释放。反观 nanoESI 纳喷电离,尤其是 TVNM 所实现的高场纳喷电离(比传统纳喷高近一个数量级的电场强度),离子化效率明显提升,更耐盐更能避免离子竞争和抑制。因而,TVNM 本身依靠后面的质谱,可以实现分离!
当然,若 TVNM 与 HPLC / nanoLC 联用,更能实现常识中的分离。
TVNM 的五种工作方式如下图所示。
05、TVNM 的流速是多少,如何保证喷雾稳定性和持续性?
典型的 TVNM 源的喷雾流速范围为200-600 nL/min,不需要连接液相,依靠自身泵压形成稳定喷雾。
TVNM 靠喷嘴与液体样品的极短距离间存在的电势差(1-2kV)形成电场,其电场强度远大于常规拉制的毛细管喷头,喷雾的稳定性极佳,无论生物大分子或有机小分子,无论正负离子模式,无论溶剂为纯有机相或纯水相,喷雾连贯无波动无间歇,特别适合短时间的高通量(标志物)重复验证、或长时间的质谱分析(如DDA、IDA、DIA 等)。
半导体工艺刻蚀经40道工序加工生成400个喷嘴,个体间的差异小于3.5%,重现性优异。
06、LESA 萃取液滴的体积有多大?
可大可小;典型的液滴体积为1-2 μL,小些的可达0.5-1 μL。
07、成像空间分辨率是多少?
LESA 的空间分辨率可达~700微米;LESA Plus 的空间分辨率可以更细,达20~400微米。当然,空间分辨和灵敏度是“鱼和熊掌”的关系。空间分辨细,每个点所取的样品内分子数就少,灵敏度就会受到影响甚至需要顶级(昂贵)质谱实现超高空间分辨的离子信号检出。若不是特别追逐空间分辨率(如非单细胞),而是研究材料或生物体组织成像及轮廓分布分析(分辨率在半毫米 OK),则灵敏度就能保证,普通质谱仪均可实现上好的成像功能。
08、成像一个点要多长时间?
单点单次的萃取时间一般为一至十几秒,重复萃取数次,信号采集时间约5-30秒,所以单点所需的总时间为十几秒至一分钟内。时长可调。
09、做成像需要切片吗?动物和植物样本都可以做吗?
成像可以做切片,也可以不做切片,动物样本和植物样本都可以做。
10、切片要求是冷冻的?还是新鲜的?
是否冷冻没有关系,新鲜和冷冻的均可。
11、同步馏分收集是自动的吗?
LESA 可与液相串联,实现在线同步馏分收集功能。该功能是自动化的,收集比例 1~99% 可调。
12、直喷,没有色谱分离和保留时间,做代谢组鉴定,结果的可靠性如何呈现?
即使没有色谱分离,因芯片纳喷(自回路电场)的离子化效率远高于电喷雾,也强于普通的拉管纳喷,如前所述,样品中的分子更能高效离子化(更耐盐、更少竞争和抑制)。进入质谱系统后,分子离子的分离极易由质谱实现,如利用高分辨质谱或 MRM 多反应监测。四大组学领域的文献,已有多篇将液质的结果与芯片多通道纳喷结果进行背对背比较的论述。利用 TVNM 芯片多通道纳喷技术,性能不仅不减,反而更可靠,灵敏度更高,稳定性和重现性更高,小分子代谢覆盖范围更宽,蛋白质鉴定(ID)和测序覆盖率(sequence coverage)更高。当然,若质谱自带二级或多级扫描功能,组学鉴定效果更加优异。
13、如想在组织表面萃取后加 LC 分离,系统是否可以实现?
可以的,LESA plus 型号(五合一)即是在 LESA 实现了液滴表面萃取后(第四项功能),提取物通过六通阀进入捕集柱(Trap Column)并分析柱(Analytical Column),以微流液相或纳流液相方式进行分离,分离物继续在线利用 LESA 的作为纳喷源(第二项功能),实现提取液经快速分离后的质谱检测。
14、LESA 能否同时萃取脂质和蛋白?
原则上可以,如脂质和脂蛋白的分析可同时进行。理论上,萃取这两种物质的溶剂略有差异:萃取蛋白需要水相的存在,萃取脂质则是甲醇/异丙醇/氯仿等纯有机相。所以需要不同的溶剂分次分步萃取或利用鸡尾酒溶剂混合法操作。若仅仅关注蛋白,可先对样品进行快速清洗,除脂和除盐,有助于蛋白质分析的灵敏度提升。
15、喷嘴是否会形成污染?
不会。喷嘴是一次性使用,不存在重复使用造成的交叉污染问题。每个样品单用一个移液枪头、芯片上的一个喷嘴(共400个,40道半导体工序加工而成,精密重现),工作站自动记录使用过的顺序和自动记录每个样品实现纳喷过程中的实时电流信号。
欲了解更多技术信息,敬请致函或文末或后台留言!
《Nature Protocol》推荐的工作流程草案常见问题及解决办法:
原因1:样品中存在颗粒物
解决方法:样品可经过4℃ 离心,并保持样品盘温度在10℃ 以上,避免样品可能的沉淀。
原因2:样品浓度太高或含盐量过高
解决方法:将样品稀释至能够产生稳定喷雾的浓度,并除盐。稀释本身也会降低盐干扰。
原因3:样品黏度低,以致取样后发生样品滴落损失
解决方法:取样后,可继续吸取一段空气(如0.5 μL),以空气封堵样品,即在“Aspirate air after sample”中填入封堵空气的体积。
原因4:芯片离质谱过近
解决方法:在“Spray Optimization”中将离子源适当后撤一点儿。
原因5:氮气压力过低
解决方法:检查氮气源压力,并通过调压旋钮将压力调至40 psi左右。
原因6:芯片位置不正
解决方法:检查并重新放置芯片。
原因7:喷雾电压/气压的设置未经优化
解决方法:优化气压和电压。
原因:样品浓度太高或含盐量过高
解决方法:将样品稀释至能够产生稳定喷雾的浓度,并除盐。
原因:样品浓度太低或较难离子化
解决方法:制备一系列高低浓度的样品来寻找能够产生稳定喷雾的浓度范围,或加入适量的甲酸、乙酸铵等辅助离子化。
原因:芯片离质谱过近
解决方法:在“Spray Optimization”中将离子源适当后撤,使其远离质谱离子锥入口。
原因:芯片离质谱过远
解决方法:在“Spray Optimization”中将离子源适当前移,使其更近质谱。
原因:取枪头的金属杆上可能存在杂物(如样品盘上的塑料封膜等)
解决方法:用二甲苯清洗金属杆,建议只用热封铝箔(heat-sealed foil)密封样品盘。
原因:触发信号未连通
解决方法:检查触发线是否存在连接错误或接触不良。
*不同品牌质谱的差异较大,只建议参考同型号的质谱参数进行设置。
常见样品的参考溶剂、质谱参数等见下期。
● 参考文献:
1. Andrew D Southam, et al. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocol, 2017. Doi:10.1038/nprot.2016.156
2. Robert L. Davidson, et al. Galaxy-M: a Galaxy workflow for processing and analyzing direct infusion and liquid chromatography mass spectrometry-based metabolomics data. GigaScience, (2016) 5:10 Doi 10.1186/s13742-016-0115-8
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