化药制剂含量测定>色谱法检测 | 小分子多肽的分离纯化-常州三泰科技有限公司

方案摘要

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应用领域	制药
检测样本	化药制剂
检测项目	含量测定>色谱法
参考标准	小分子多肽

随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。因适应症广、安全性高且疗效显著，多肽药物已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景[1]。在多肽药物的制备方法中，固相合成法具有产率较高且能够实现自动化等优点。然而，其缺点也十分明显，即每步中间产物不能纯化，且最终产物必须经过可靠的分离手段进行纯化。常用的多肽分离纯化方法包括离子交换色谱法（IEC）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等，这些方法存在样品载量低、分离介质价格昂贵、分离设备复杂且成本高昂等缺点。本文以胸腺五肽为样品，通过SepaFlash Bio C18反相柱与SepaBean machine联用，成功地实现单次进样即可获得高纯度（>94%）的多肽产品，为此类小分子多肽样品的分离纯化提供了一种高效、快速且成本低廉的解决方案。

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配置单

SepaBean machine 2快速制备液相色谱
型号：SepaBean machine 2-专家型

¥20万 - 30万
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SepaBean machine快速液相制备色谱
型号：SepaBean machine

¥20万 - 30万
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键合相系列 SepaFlash快速液相制备色谱柱
型号：

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方案详情

实验部分

1. 样品

文中所用多肽样品为胸腺五肽（Thymopentin，以下简称TP-5），TP-5是胸腺生成素II第32-36位的氨基酸残基片段。TP-5的分子式是C₃₀H₄₉N₉O₉，分子量为679.41 Da，其化学结构式如图1所示。本文中的TP-5粗品采购自无锡亚肽生物科技有限公司。

图片1.jpg

图1. 胸腺五肽的化学结构式。

TP-5主要具有诱导T细胞分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化的功能。临床上TP5主要应用于治疗肿瘤、单纯疱疹、类风湿性关节炎、艾滋病、严重免疫缺陷综合征和慢性乙型肝炎等疾病^[2]。

2. 仪器和设备

本文所用Flash柱为12g SepaFlash Bio系列C18反相柱（货号：Bio-SW-5223-012-SP），填料粒径15μm，孔径100Å。此Flash柱与一台快速液相制备色谱仪联用，用于TP-5样品的快速制备纯化。

TP-5粗品及纯化后产品的纯度分析采用Agilent 1100 HPLC系统，所用分析柱为Diamonsil 5μm C18分析柱（4.6 x 150 mm，Dikma）。流动相及洗脱梯度设置参见表1。

表1. HPLC流动相及洗脱梯度设置

流动相	Solvent A：水(5%乙腈，0.05%三氟乙酸)； Solvent B：乙腈
流速	1.0 ml/min
洗脱梯度	% Solvent B	Time / (min)
	0	0
	0	3.0
	30	6.0
	100	12.5
	0	13.0
	0	15.0

TP-5纯化后产品的质量数确认采用一台LC-MS系统，为Shimadzu LC10A液相色谱仪与AB Sciex API2000质谱检测器联用，所用HPLC柱为ZORBAX 3.5μm XDB-C18（2.1 x 50 mm, Agilent）。流动相及洗脱梯度设置参见表2。

表2. LC-MS流动相及洗脱梯度设置

流动相	Solvent A：水(5%乙腈，0.05%甲酸)； Solvent B：乙腈
流速	0.5 ml/min
洗脱梯度	% Solvent B	Time / (min)
	5	0
	60	2.0
	60	4.0
	5	4.2
	0	6.0

3. 实验方法

将45mg的TP-5粗品溶于1mL甲醇-水溶液中（v:v = 3:7），然后利用注射器将样品溶液加入Flash柱中，之后开始进行Flash制备纯化。实验相关参数设置参见表3.

表3. Flash制备实验参数

仪器	SepaBean machine
色谱柱	12g SepaFlash Bio C18反相柱（填料粒径15μm，孔径100 Å，订货号：Bio-SW-5223-012-SP）
样品量及上样方式	45 mg粗品，溶解后注射器进样
检测波长	220 nm；254 nm
流动相	Solvent A：水；Solvent B：甲醇
流速	20 ml/min
洗脱梯度	% Solvent B	Time / (min)
	10	0
	90	10.0
	90	12.0

结果与讨论

本文中，45mg的TP-5粗品（纯度80.5%，参见图2）在溶解后进样，利用12g的C18反相Flash柱仅通过单次实验即可完成全部样品的分离纯化，纯化色谱图如图3所示。将编号为002和003的两管收集组分合并，经冻干处理后，称重为27.5mg，利用HPLC分析其纯度为94.1%（参见图4），则可以得出TP-5的回收率为75.3%。经LC-MS鉴定，确认产品的分子量符合预期（参见图5）。