【应用笔记】- Amersham Typhoon™在染色质DNA水平的调控（一）之染色质复制

北京德泉兴业商贸有限公司

2018/11/01 16:15

伴随着激光共聚焦扫描成像仪Amersham Typhoon™ 进入市场数十年，其在各方面的应用也在不断发展。我们搜集了用户在使用Amersham Typhoon™进行的各方面研究成果，分享给大家。今天，我们先来介绍Amersham Typhoon™在染色质DNA水平的调控中的应用之染色质复制。

在真核生物中，目前有关DNA复制的相关机制研究比较深入，然而对染色质的复制和表观遗传信息传递的分子机理尚待深入的研究。DNA的复制往往伴随着染色质结构的组装，因而子链上核小体的组装和DNA合成是紧密耦联，这一过程可以称之为DNA复制耦联的核小体组装（DNA replication–coupled nucleosome assembly），对维持基因组的完整性具有重要作用。尽管此前许多研究发现了一些组蛋白分子伴侣参与核小体组装，但是这一过程是如何耦联到DNA复制上的这一具体分子机制仍然不清楚。

2017年在Science上发表的” RPA binds histone H3-H4 and functions in DNA replication–coupled nucleosome assembly”一文，报道了一个能够结合单链DNA的重要复制蛋白A（RPA,replication protein A）复合体在DNA复制耦联的核小体组装中的重要作用，对阐释DNA复制耦联的核小体组装具有重要意义。

该研究首先通过co-IP分析得出RPA蛋白与组蛋白H3-H4在S期能形成RPA-H3-H4复合物。为了研究该复合物对形成DNA-组蛋白复合物的影响，该研究设计了模拟新解旋复制叉的ss-dsDNA和对照dsDNA，使用EMSA实验进行分析。结果表明：H3-H4与ss-dsDNA和dsDNA（H3-H4形成了二聚体和四聚体，dsDNA-(H3-H4)复合物出现两条带）均能结合（蓝色箭头）。发现PRA与ss-dsDNA能够形成RPA-DNA复合物（绿色箭头），而与dsDNA结合能力很弱，表明RPA结合在ss-dsDNA中的单链部分。随着RPA浓度的增加，形成的RPA-DNA-(H3-H4)复合物增多（红色箭头），表明RPA促进DNA与H3-H4的结合；而在dsDNA中，则无此作用。

进一步，为了确定H3-H4组装到ssDNA还是dsDNA上，结合EMSA加入了HhaI酶切。结果表明，当H3-H4结合后，对ss-dsDNA形成了保护作用，使其不能被切断（蓝色箭头），从而确认H3-H4组装位置在双链DNA上。

结合其他实验，该研究发现：RPA能够直接结合没有修饰的H3-H4组蛋白复合体，促进ssDNA-(H3-H4)复合体的形成，并能迅速的将H3-H4连接到相邻的dsDNA上，同时招募一系列组蛋白分子伴侣（CAF-1、FACT和Rtt106）协助新的核小体的组装。

这一研究表明，RPA在新生染色质上的核小体组装中起到重要作用，其通过协调多个组蛋白伴侣，将组蛋白掺入到复制叉上，为DNA复制偶联的核小体组装提供了一个很好的“平台”。

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