一、仪器设备:
1.亲和层析管柱 (Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm)
2.部分收集器 (另需准备干净试管约25 支)
二、药品试剂:
1.金属螯合亲和层析胶体(Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210):1 mL。在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基,可以螯合镍离子;使用前先以镍离子饱和的。
2.Buffer B-300/0(50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl),使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。
3.Buffer B-300/20:Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
4.Buffer B-300/250:Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole
三、方法步骤:
1.亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内,成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上,去除下方的填塞物,用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口,准备注入样本。
2.除去胶面上方的缓冲液,并取出样本 (IEX) 使其回到室温,慢慢用滴管加到亲和胶体上,小心勿弄乱胶体表面;让样本没入胶体中,同时收集流出液每管2.5 mL。
3.待样本全部进入胶体后,关闭出口,再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液;buffer B-300/20 共流洗30 mL。
4.接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上,收集。
5.所有收集均定量蛋白质并测定酶活性,取收集酶活性最高的数个,共得 _______ mL (AF),保留100 μL 以供分析。
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