细胞复苏冻存和超低温冰箱存储实验方法步骤分享

细胞复苏冻存和超低温冰箱存储实验方法步骤分享

    最近一直在做细胞实验，逛论坛发现很多人在细胞实验中常遇到：细胞冻存后很难复苏，或者复苏后出现大量死亡细胞。细胞的状态直接影响后续的实验，以下从细胞复苏、细胞冻存和细胞超低温冰箱存储，三个方面分享我们实验室的方法，不敢说权威，但真的总结了自己多年来的一些经验教训，供大家参考：

细胞复苏

1）75％酒精擦拭超净工作台，放置已消毒的培养瓶、吸管等，紫外线照射20min；

2）冰箱中取出冻存管并迅速放入已预热的37℃水浴锅中，不断摇动，使冻存管迅速融化（快溶过程）；

3）将冻存液移至加入4mL细胞培养液的离心管中；

4）将细胞悬浮液1000rpm离心5min；

5）吸取上清液，用1mL培养液重悬细胞；

6）在细胞培养瓶中加入4mL培养基，然后将1mL细胞悬液接种至培养瓶中，轻轻混匀，将培养瓶放入CO2培养箱中培养；

7）24h小时内更换一次培养液，继续培养。

细胞冻存

1）75％酒精擦拭超净工作台，放置已消毒的培养瓶、吸管等，紫外线照射20min；

2）去除旧培养液，用PBS冲洗2次，细胞培养瓶中加入600μL胰蛋白酶，显微镜下观察细胞，若细胞回缩、细胞间隙扩大、细胞开始变圆，轻轻拍打细胞培养瓶，加入5mL培养液终止消化；

3）将细胞悬浮液转移至离心管中，1000rpm离心5min；

4）离心后的细胞，弃上清加入1.5mL预冷的细胞冻存液，混合均匀后移入冻存管中，放入细胞程序降温盒（慢冻过程），短期使用的细胞可保存于-80℃冰箱中。

细胞超低温冰箱存储

　　通过上面辛苦操作得到的细胞，在存储上一定得小心，吐槽下我们实验室经历过的惨痛教训：

存储空间划分与管理

以前问题

    因为实验室人比较多，冰箱每个人存储空间划分不合理（长期被师兄师姐占领大部分空间，无力吐槽啊），大家样品都乱存乱放（划分不合理，其他人只能见缝插针了）。冰箱门反复开关，样品找寻时间过长，直接导致冰箱漏冷，且因为温度不均造成细胞反复冻融，大大降低了细胞质量。

解决办法

    1）建立相关流程及管理规则（根据大家的存储量，合理划分；定期进行冰箱样品清理，保证空间合理利用；老板牵头引起大家重视；建立惩罚措施，确保严格遵守）

    2）若实验要换置冰箱，建议购买一个智能些的

　　我们实验室培养了几十株细胞，实验组五人存放冻存细胞时，选择查询“***细胞”，所有的存取位置一目了然，再打开冰箱门，直接找到位置进行取放，一步到位很方便。

　细胞复苏、冻存及存储操作一直都是细胞实验中最基础的工作，很多时候后续实验出现问题，很大一部分原因都是因为这些基础工作做的不到位，根据自己实验室条件，合理优化上述步骤与方法，相信你的细胞实验未来能更加顺利。

    低温冰箱主要用途:用于科研研究、医辽用品的保存（血浆）、生物制品（储存器官，疫苗，土样）、远洋制品、电子元件、化工材料等特殊材料的低温实验及储存等，在医院、大学、研究单位和工业存储上用得较多。

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