供货周期: | 7天 |
品牌: | Sigma-Aldrich |
型号: | 10000u |
货号: | M1701 |
CAS号: | 此产品无CAS号 |
M1701 反转录酶M-MLV 反转录酶M-MLV 进口/国产 10000u 支
M-MLV 逆转录酶是从Moloney Murine Leukemia Virus分离出来的,是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶,可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成;同时具Ribonuclease H (RNase H)酶活性,可以选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA,但不剪切单链RNA或双链RNA。
反转录酶M-MLV应用领域:RT-PCR 和cDNA合成;引物延伸。
逆转录酶(M-MLV)一个活性单位定义为在37℃,10min条件下,使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。
二、试剂盒组份
组份 Cat:BM371(4000 u) Cat:BM372 (1000 u) Cat:BM373 (20000 u)
逆转录酶(M-MLV) 20μL 50μL 100μL
10× M-MLV Reaction Buffer 60μL 150μL 300μL
DTT 30μL 80μL 150μL
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
无RNase酶的1.5m L离心管,可调移液器,PCR仪,无RNase的无菌水,dNTPs (10mM),引物(Oligo dT(18)或随机引物或特异性引物),RNA模板,RNase抑制剂
四、反转录酶M-MLV保存条件:
-20℃保存,一年有效。
五、注意事项:
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
A、cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesis):
1、使用前每个组份轻轻混匀,然后2000rpm离心20s。
2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管,参考如下表格设置反转录反应(20μL反应体系):
模板(后面3种任选一种) Total RNA 0.01~5μg(n μL)
或Poly(A) RNA/mRNA 1~500ng(n μL)
或Specific RNA 0.01pg ~500ng(n μL)
引物(后面3种任选一种) Oligo(dT)18 1μL
随机引物 1μL
特异性引物 1μL
d NTPs 1μL
无RNase的无菌水 To 15.5μL
65℃孵育5分钟,随后立即放置到冰浴冷却5min,4℃微离心,随后加入下述试剂
RNase抑制剂(40u/μL) 0.5μL
10× M-MLV Reaction Buffer 2 μL
DTT 1 μL
逆转录酶(M-MLV) 1 μL
总体积 20 μL
3、反转录酶M-MLV轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀),随后2000rpm离心20s沉淀液体。
4、如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物,在37℃孵育60分钟。如果使用随机引物作为引物,先在25℃孵育10分钟,随后在37℃孵育60分钟。注意:对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应,可以设置为42℃孵育60min。
5、70℃孵育10min以失活逆转录酶并终止反转录反应。
6、反转录产物可以直接用于下一步的PCR反应,也可以-20℃冻存以备以后使用。
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