从1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始,测序技术发展至今已有四十多年时间,先后经历了以GS FLX、Solexa、SOLID为基础的二代测序技术,以及基于单分子实时测序(SMRT)和纳米孔测序技术的三代测序技术。虽然三代测序在蓬勃发展,并在基因组和转录组测序等领域展现出前所未有的优势,但限于成本问题,其应用范围尚不及二代测序。
二代测序技术以其短读长、高通量、准确性高的特点,仍在测序市场上占优势地位。以Illumina Solexa为例,首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库,加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面,经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”,实现碱基信号强度放大,采用边合成边测序的方法,进行全基因组全面,准确的测序。
图1 Hiseq Xten (左) 与 NovaSeq 6000(右)
2014年Illumina推出HiSeq X Ten测序仪,它利用数十亿个纳米孔的流动槽,较大缩短了测序周期。2017年它又推出了新一代测序仪NovaSeq系列,我们以相同文库分别进行Hiseq Xten系列和NovaSeq系列测序,DNA重测序产出数据指标如下:
表1 DNA重测序结果比较
看完重测序,再看看转录组文库测序比较:
表2 转录组测序结果比较
基于以上结果,图谱君总结了以下几点:
1.测序原理:X-ten与Nova6000测序原理均是基于solexa的边合成边测序的原理;Nova6000采用Illumina的EX-AMP簇生成技术,以及新一代的Patterned Flow Cell。
2.Q30质量值:在实际测序中Nova6000的Q30相对于X-ten更稳定且测序时长更短,试剂衰减对质量影响更小,整体的Q30 Nova6000要优于X-ten。
3.测序方式:受限于X-ten的控制软件以及试剂等因素,X-ten只能进行单Index的测序识别;而Nova6000可以进行I7 I5双端Index的测序,理论上可以做到更精准的识别。
4.DNA文库冗余度:Nova6000明确优于X-ten平台。
有没有发现随着二代测序仪器的发展,测序结果真是又快又好,目前二代测序较多的应用于基因组重测序,转录组分析,小分子RNA研究等领域。基于二代测序技术进行遗传图谱构建,基因定位的研究也越来越多。
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