实践证明,法医DNA检测技术和相关仪器在犯罪嫌疑人认定、亲权鉴定和系列串并案侦破中发挥了显著作用,是我国公安一线侦察破案和打击犯罪的重要技术手段。以法医DNA检测技术为主线,对相关仪器的产生背景、发展历程、工作原理、各类技术优劣,以及国内外研究现状进行了综述,最后对国内该领域技术发展方向和相关政策等提出了系列建议。
法医; DNA检测; STR; 遗传分析仪; 片段分析;
随着科技的发展,法医DNA检测技术在公安一线已成为个体识别、打击犯罪不可或缺的科学利器。三十多年来,法医DNA检测技术经历了多位点DNA指纹图分析技术、扩增片段长度多态性分析技术(AMPFLP)、线粒体DNA(mt DNA)检测技术三大技.目前已发展到以荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术、线粒体DNA (mt DNA)检测技术和SNP分析技术为主导的技术体系。 其中,针对DNA片段长度多态性检验的STR技术是当前国内外DNA检验领域采用的主要手段。
此外,线粒体DNA因具有高度序列多态性也可用于个体识别、亲缘鉴定,并且对于陈旧、腐败或只含角化细胞的检材分析上具有核基因组DNA没有的优点,在法医学中有不可替代的应用价值, 日益成为实验室的常规检测方法;SNP分析也具有个体识别和亲权鉴定的能力,累积识别率可以达到与DNA多基因座指纹图同样水平,虽然目前尚未形成成熟的SNP位点检测体系,但该技术的诸多优点使其有望成为未来的常规法医DNA检测技术。以上这些技术的实现离不开相应的检测平台,法医DNA检测仪器的发展决定了各种法医DNA检测技术的实用性能和发展速度。因此,该类仪器逐渐成为法庭科学领域和分析仪器领域的研究热点。
一、 仪器平台发展历程
作为法医DNA检测不可或缺的平台和工具,主流的法医DNA检测仪器大致经历了两个阶段的发展。第一代DNA检测设备产生于上世纪80年代,其核心技术为平板凝胶电泳,电泳通路由包含许多小孔的固态介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液组成,DNA分子在凝胶中完成电泳过程,电泳分离后,采用UV光源和照相机对已染色的DNA分子进行荧光激发和拍照分析。早期的多位点DNA指纹图和AMPFLP、STR等位基因等均采用平板凝胶电泳进行检测,由于检测效率低,需要大量的技术人员参与。第二代DNA检测仪器以集成化、自动化为基础,开始于上个世纪90年代,为大规模的基因测序奠定了基础。
1995年,美国AB公司推出了377型平板式遗传分析仪(通常将具有DNA测序功能的仪器称为DNA测序仪,而将可以检测和分析DNA片段长度多态性的DNA测序仪称为遗传分析仪),采用薄层聚丙烯酰胺凝胶分离DNA分子,使用Sanger末端终止法、四色荧光标记,通过读取这四种荧光信号获得待测样品的序列。该仪器采用的平板电泳铺胶麻烦,因此迅速被采用毛细管电泳技术的平台取代,此测序技术的产生和发展源于生物技术中的双脱氧终止法和PCR反应,目前已经成为应用最广泛、技术最成熟的主流技术。此后虽然出现了一些新的技术与方法,如2005年初美国贝勒医学院和莱斯大学的研究人员研制出的“色盲” 荧光检测方法、2005年美国454 Life Sciences公司研究人员发明的微流控芯片技术等,在某些方面也取得了令人满意的效果,但都存在着不同程度的缺陷,短期内在常规的法医DNA检测设备中难以进行大规模的应用和推广。
我国法医DNA分析技术起步较早,早在1985年国际上首次报道DNA指纹技术应用于法医鉴定以来,我国法庭科学工作者就开始了这方面的研究工作,但仅仅局限于一些试剂、引物以及分析方法的研究,在仪器设备方面则一直依靠进口国外产品来满足需求,形成了对国外产品的高度依赖。 针对上述情况,国内一些科研院所曾经开展过DNA检测平台硬件方面的研究探索工作,但都是针对法医DNA专用检测平台硬件的某个局部,虽具有一定的实用价值,但无法形成完整的技术体系。直至“十一五”前期,国内尚无法医DNA检测平台硬件生产厂家,在这方面的技术自主性相对较弱,尤其在主流技术、核心技术的掌握上极其匮乏,基本处于被动接受、被动更新的境地。
为此,“十一五”期间我国在相关领域加大了科研投入,国内多家公司和研究所先后取得了突破性的成果:深圳华因康基因科技有限公司研制成功了Pstar-II系列高通量基因测序仪;中科院北京基因组研究所与中科院半导体研究所研制成功了基于第二代测序技术的模块化DNA分析系统;中科院北京基因组研究所与浪潮集团共同启动了基于第三代测序技术的DNA测序仪研制,公安部第一研究所成功研制了法医DNA专用检测遗传分析仪。这些国产DNA检测平台正在逐步建立并走向成熟,在不久的将来可摆脱相关领域受制于人的困境。
二、 主流仪器平台组成及工作原理
如前所述,荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术自上世纪90年代诞生以来,由于STR等位基因具有诸多适宜于法医DNA检验的特点,一直是法医DNA检测的主流技术。STR等位基因的检验依据是DNA片段的长度多态性, 用于DNA片段分析技术的检测手段主要有三种:激光诱导荧光检测技术、微流控芯片技术和飞行时间质谱技术。基于激光诱导荧光检测的自动化遗传分析仪应用最早,技术最为成熟,是目前唯一实现商业化生产、全面配套和大规模应用的仪器,但是该技术的仪器设备体积较大、配套消耗品成本较高。微流控芯片技术具有微型化、快速(检测速度是常规技术的10~100倍)、灵敏度高、样品消耗量小、重复性好等特点,可以实现DNA检验设备的小型化、 便携化,但是该技术在法医DNA检测上的应用目前还不成熟,一些技术难点还没有攻克。飞行时间质谱技术具有快速(单个样品检验时间5分钟)、抗干扰、不需要复杂的试剂配套、样品消耗量小等特点,但该技术同样存在仪器设备体积较大以及技术不成熟等问题。
综上,激光诱导荧光检测技术目前仍是国际上应用最广泛、技术最成熟的主流技术。国内外用于法医DNA检测的仪器平台均基于该技术,该类型的遗传分析仪产生于上世纪80年代,目前已经过多次技术更新,主要体现在分离系统和光电检测系统两个方面。分离系统经历了两代技术发展,第一代的核心技术为垂直板电泳技术,其光电检测系统以光电倍增管(PMT)为核心;第二代的核心技术为毛细管电泳技术,其光电检测系统以电荷耦合器件(CCD)为核心。
目前商业化仪器大多采用毛细管电泳技术作为分离系统,采用PMT或CCD作为光电检测系统,这种仪器平台的主要工作原理如图1所示,用“电动进样” 的方法将带负电荷的待检DNA片段分子迁移到注满凝胶的毛细管进样端(负极),然后在毛细管两端加上直流电压,被荧光标记的DNA片段在一定的温度和电压条件下在毛细管内进行电泳,样品中不同大小的DNA片段开始从负极向正极方向移动,由于受到具有分子筛效应的凝胶的阻滞,据其分子量大小而具有不同的迁移率,片段越短,移动得越快,电泳的结果使长度不同的DNA片段互相分离, 并且按片段的长短顺序通过检测窗口。当标记有荧光素的DNA片段移动到检测窗口时,激光束在检测窗口处对标记在DNA片段上的荧光素进行激发,荧光素受到激发而发出特定波长的荧光,此荧光信号被光电检测系统(CCD检测器)所采集并被转化为电信号,经数据处理后存储到计算机进行下一步的分析处理。
为了确定DNA片段的长度,与样品一同电泳的还有分子量内标,分子量内标是已知分子量的DNA片段,其上附有特定荧光波长的荧光素。计算机根据荧光信号的出现时间,与特定荧光波长的分子量内标信号出现时间进行比对,确定待测DNA片段的分子量大小(即片段长度)。再通过荧光的波长范围来定位该DNA片段所在的STR基因座(其对应关系由STR复合扩增试剂盒决定),从而获得被检STR基因座的基因型。依此方法分析试剂盒中多个STR基因座的检测结果,即可确定被检DNA样品来源的个体基因型,实现个体识别。
根据荧光标记多基因座STR复合扩增检测体系的要求,一个完善的基于“毛细管电泳激光诱导荧光检测技术”的遗传分析仪应具备下列性能:
(1)电泳电源具有高稳定度的恒压性能,以确保电泳过程中DNA片段迁移率恒定;
(2)实现具有排气泡功能的毛细管高压凝胶注入, 满足毛细管自动注胶的要求;
(3)具有较高的电泳温度控制精度:STR等位基因的电泳检测温度要求在60℃±0.1℃,以确保作为筛分介质的凝胶工作在最佳温度,获得DNA片段的最佳电泳迁移率, 确保多个毛细管电泳通道的检测结果具有可比性,确保多次DNA检测的结果具有良好的重现性;
(4)配备高灵敏低噪音的光电检测器,以采集微弱的荧光信号,从根本上确保样品具有极高的检出率;
(5)能进行精确的进样控制,以确保多通道样品进样和多次检测结果的一致性,确保毛细管准确定位在样品池、缓冲液池、清洗池、废液池中,实现进样、电泳过程的全自动化。
要实现以上性能,遗传分析仪中除包含有毛细管电泳通路外,其组成还包括高稳定度的高压电泳电源、全自动注胶系统、三维进样机构、高精度恒温箱、激光诱导毛细管内荧光激发系统、毛细管内荧光高灵敏度检测系统以及实现全自动控制的嵌入式测控系统、外部计算机工作站的数据预处理及分析系统。上述各功能模块有机结合,依照不同的法医DNA检测流程,在整机测控程序的驱动下,实现了DNA遗传信息的有效检测和分析。
三、 国外仪器的最新发展
毛细管电泳的主要缺点是检测通量相对较小,因为每个样本必须依次进行分析,单根毛细管的电泳装置不适用于大量样本的分析。为此,国外公司先后研发了各种通道的遗传分析仪,这些仪器在通道数增加的同时,在注胶系统、恒温系统、光学系统、进样机构等部件及配套软件上进行了更加精细的改进,提高了仪器的检测性能。
上述遗传分析仪的另一功能是测序,可以实现其它法医DNA检测功能,包括mt DNA序列检测和SNP多态性检测。这些仪器的测序原理均基于Sanger发明的末端终止测序法,该方法因为既简便又快速,并经过后续的不断改良,成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展,传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术应运而生。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序,即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点, 454 FLX的测序片段比较长,高质量的读长能达到400bp; Solexa测序性价比最高,不仅机器的售价比其他两种低, 而且运行成本也低,在数据量相同的情况下,成本只有454测序的1/10;SOLID测序的准确度高,原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%,是目前第二代测序技术中准确度最高的。
第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破,但是仍然建立在PCR扩增的基础上。为了避免PCR扩增带来的偏差,实现更快的检测速度,科学家目前正在研制对DNA单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Heliscope单分子测序仪,SMRT单分子实时合成测序法,Ion torrent半导体测序技术,Oxford纳米孔测序技术等。Helicos Biosciences公司的Heliscope技术仍然是基于合成测序原理,采用极高灵敏度的荧光检测仪识别测序时的荧光信号,能够直接记录到单个碱基的荧光,从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。Pacific Biosciences公司研发的单分子实时合成测序法(SMRTTM),充分利用了DNA聚合酶的特性,可以形象的描述为通过显微镜实时观测DNA聚合酶,并记录DNA合成的整个过程。AB公司的Ion Torrent新一代测序仪则利用硅芯片检测测序反应时氢离子的转移,由于不需要荧光标记,有效降低了测序成本。Oxford Nanopore的纳米孔测序技术也不需要荧光标记,使用核酸外切酶消化单链DNA分子,逐一剪切下单个碱基,利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同,或者不同碱基通过小孔的能力各有差异,来加以区分不同的碱基信号。新一代测序技术的应用领域相当广泛,除了在科研领域, 在临床医学及食品安全领域也有着广泛的应用前景。
第二代测序仪和第三代测序仪虽然大幅提高了检测通量,但由于其读长较短,后期数据拼接繁琐,对具有重复序列的STR等位基因难以进行检测分析。且第二代测序仪的一次样品制备及检测时间以星期为单位,难以满足法医DNA检测的快速要求。因此,采用新一代测序技术进行STR基因分型在未来很长一段时期内仍无法实现,但其测序功能可作为法医DNA检测的辅助手段,用于mt DNA序列和SNP位点等多态性检测。
值得关注的是,近年来,以微流控芯片代替毛细管阵列的遗传分析仪取得了长足的发展,Rapid HIT 200 DNA快速检测仪、P-DNA Analyzer已正式推出,这些仪器集成了DNA提取等样品前处理流程,体积小,使用简单,适用于现场检测;但其样品要求相对严格,检测成本相对较高, 限制了其大范围应用。
四、 国内仪器的发展展望
由于法医DNA检测仪器涉及领域多、技术难度大、系统集成度高、仪器与消耗品和试剂的联系紧密,因此开发和生产的难度很大,此前国内尚无与法医DNA检测技术相配套的仪器、试剂和消耗品一体化的专业生产厂家。为改变上述状况,公安部所属的部分科研单位,近年来对法医DNA的检测技术逐步开展了深入的研究,已经取得了显著的成果,形成了法医DNA专用检测仪器、试剂、配套软件及耗材的国产化全面解决方案。
基于国内已有的仪器平台基础,根据我国各地DNA实验室的应用需求,笔者认为国内法医DNA检测仪器还应主要向两个方向发展:
(1)充分优化整合实验室资源,设计建立一套适合我国国情、相对经济、高通量的自动化DNA检验技术方案。按照DNA检验流程,实现被检样品在法医DNA实验室各种设备及检测仪器间的自动流转和处理,生成的DNA检测数据自动集中存储,确保检测结果的可溯源性,形成一套具有统一操作规范、科学判断标准、独立知识产权的法医DNA实验室系统解决方案。
(2)建设同时具备设备、软件、试剂和耗材研发能力的大型研究与科技成果转化平台,形成具有核心竞争力的产品体系。随着新应用、新需求的不断增加,我国在法医DNA检测技术领域的研发任务仍然艰巨,要形成有竞争力的国产仪器平台,必须实现检测方法、检测仪器的一体化研发,并根据法医DNA检测技术的最新发展,加紧开发具有自主知识产权的下一代系列产品,提升国产仪器的核心技术价值。
目前,我国法医DNA数据库建设逐步完善,数据录入量以每年近600万的速度大幅增加,法医DNA检测技术在犯罪嫌疑犯认定、亲权鉴定和系列串并案中的作用越来越显著,公安一线对法医DNA检测仪器的需求日趋强烈。可见,我国的法医DNA检测仪器具有广阔的应用和发展空间。
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