开启小颗粒世界之门，干货满满纯实战经验分享

流式细胞仪检测颗粒的散射光信号，但是小颗粒折射率小，对应散射光信号也小，因此小颗粒研究难度系数高。小颗粒包括细菌、病毒、细胞外囊泡、脂质纳米颗粒等，对应的折射率依次减少，挑战也就越来越大。

流式细胞术多参数、高通量、应用普及等显著性优势，使其成为了小颗粒研究的重要方法之一。不管是单颗粒还是批量检测平台，对于小颗粒的检测均是各有优劣，而流式细胞术是其中能够实现应用最为广泛的选择。

市面上真正能够检测小颗粒的流式细胞仪型号寥寥可数，该领域的研究不管是对仪器性能，亦或者是操作者的专业性，都提出了更高的要求。流式细胞术最早是基于细胞为对象设计优化的，小颗粒散射光信号弱，表面分子数量极少，因此要求流式灵敏度足够高才能看得清。另外，流式结果的标准化困难也是限制小颗粒应用的原因之一，而人为引入的误差又让结果的准确性打上一个问号。

这三组概念在流式应用中容易被混淆：

跟细胞样本相比，小颗粒样本的信噪比更低，因此对流式细胞仪的首要要求就是，clean！不仅仪器的液流系统要保持足够干净，样品和试剂的缓冲液也要注意过滤，以此来降低背景噪音。而提高信号需要将仪器的光路校准到最佳状态，获得最优信噪比。

对于小颗粒实验设置我们经常会纠结于阈值应该设置在散射光还是荧光参数上，答案是，需要根据我们的应用需求来决定。以散射光来设置阈值，标记和未标记的颗粒都会被检测，缓冲液背景信号会增多；以荧光来设置阈值，只有标记荧光的颗粒会被检测到，缓冲液背景影响会变小，但是受限条件是并非所有EV都有特异的荧光标记指标。从流式图的对比能够直观地看出两种阈值设置下结果呈现的差异，但统计的MESF结果应当是一致的。

仪器散射光和荧光强度结果的校准，都需要依赖于参考标准换算成具有可比性、可溯源的数值，这样获得的结果才可以在不同仪器间进行对比。

小颗粒跟细胞不同，表面结合位点少，建议尽量选择亮度高的染料。选择荧光素的时候，PE这类大分子荧光染料就不推荐使用，可能会带来假阳性结果。由于颗粒小，结合位点更近，抗体可能有空间位阻，染料可能会发生荧光共振能量转移（FRET），引起部分荧光猝灭。因此共表达的指标不要选择过多。

阴性和单染对照同样是小颗粒实验必不可少的设置，全光谱流式能够扫描出不同来源EV的自发荧光光谱的形状差异，根据分析需要进行自发荧光提取。单染对照除了用于解析，跟多标进行对比可以检查染料是否发生FRET。在小颗粒实验中，遵循文章标准要求，至少需要设置8种对照，而从调查结果来看，大部分研究人员希望尽量做齐所有对照。

建议根据MIFlowCyt-EV列出的报告框架，从设置实验、样本制备、上机实验到结果分析，每一步都按照标准要求完成，能够保证结果的准确性与重复性。

通过对比了SP Aurora（Small Particle Aurora，带ESP模块）和SD Aurora（Standard Aurora）在校准单位下分析门内小颗粒的浓度，当门设置在低于1μm的位置（紫色虚线），SP Aurora检出小颗粒浓度更多，也证明了ESP带来灵敏度的提升；当门设置在相同范围内（红色虚线范围内），2台仪器测出的浓度一致。说明了校准带来不同仪器间结果的可比性。

Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术领先的生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 ——Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。

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注：Cytek^®, Tonbo Biosciences, cFluor^®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek^®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。