方案摘要
方案下载| 应用领域 | 农/林/牧/渔 |
| 检测样本 | 畜牧 |
| 检测项目 | 动物疫病>牛病, 猪病, 其他 |
| 参考标准 | GBT18648-2020dz |
在试验成立的前提下,待检样品阻断率>50,则判定为ASFV抗体阳性;待检样品阻断率
猪瘟夹心ELISA抗体检测步骤
猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。
一、实验试剂
1、酶标抗原:辣根过氧化物酶标记的重组P54蛋白
3、对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清。
4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液
（配制方法： Na2CO3 0.318g；NaHCO3 0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）
5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS )
（配制方法： pH7.4 PBS 1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）
6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS)
（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA 10 g 现配现用）
6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)
（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml 现配现用）
7、 TMD底物溶液
（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。 底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）
8、终止液(2 mol/1 硫酸)
（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889m去离子水中,室温分装保存）
二、仪器设备
1、酶标仪。
2、恒温孵育箱。
3、洗板机或洗涤瓶。
4、96孔酶标板。
5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S
6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-300
7、4道储液槽60ml 1个 RES-60-4
8、封板膜 FDT-CP30
9、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF
包被酶标板
ASFV重组P54蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.1g/mL,按每孔100L的量包被96孔酶标板,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。
三、实验步骤（图片仅为实验模拟图）
1、酶标板上对照和样品的分布图,见下图。在A1和B1孔加入ASFV阳性对照血清各50μL,在C1和D1孔加入ASFV阴性对照血清各50μL;剩余孔中加入待检样品血清50 μL。
样品加样记录表
1 | 2 | 3 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | P | ||||||||||
B | P | ||||||||||
C | N | ||||||||||
D | N | ||||||||||
E | |||||||||||
F | |||||||||||
G | |||||||||||
H |
说明：
P为阳性血清对照孔
N为阴性血清对照孔
空白为待检血清孔
2、轻轻振匀孔中样品(勿溢出),37℃孵育20min。
3、 甩干ASFV抗原包被板孔中的液体,每孔加入300μL洗涤缓冲液,洗涤5次,在洗涤和加入下一个试剂前,避免孔壁变干。
4、 每孔加入50μL的酶标抗原(1x);37 ℃孵育20 min。
5、甩干ASFV抗原包被板孔中的液体,每孔加入300μl,洗涤缓冲液,洗涤5次,在洗涤和加入下一个试剂前,避免孔壁变干。
6、每孔加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B;37 ℃避光孵育10min。
8、 每孔加入50μL终止液终止显色反应;使用酶标仪测定450nm波长处的OD值。
四、试验成立条件
OD450-NC值≤0.15且OD450-PC值≥0.6,试验结果有效;否则重新进行试验。
注:阴性血清的平均OD值即为OD450-NC;阳性血清的平均OD值即为OD450-PC。
5、 夹心ELISA抗体检测结果判定
Cut Off值按公式计算:
Cut Off=OD450-s-OD450-NC
式中:
OD450-s --待检血清样品 OD450值;
OD450-NC--阴性对照血清 OD450值。
在试验成立的前提下,Cut Off值≤0.15,则判为ASFV抗体阴性:Cut Off值>0.15,则判为ASFV抗体阳性。
广州市程淇生物技术有限公司
GuangzhoulCF Biotech Co.,Ltd
文献贡献者
fluidot蠕动泵分液器在牙膏金黄色葡萄球菌检验中的应用
fluidot移液类产品在牙膏中耐热大肠菌群检验中的应用
牙膏中微生物检验样品的采集、保存及供检样品制备
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