自动菌落计数仪在饮用天然矿泉水粪链球菌检测中的应用

自动菌落计数仪在饮用天然矿泉水粪链球菌检测中的应用

方案摘要：粪链球菌，为革兰氏阳性 ，单个、成双或短链排列的卵圆形球菌，无芽孢、无荚膜；呈现菌形圆或椭圆，可顺链的反向延长，直径0.5-1.0微米，大多数成双或短链状排列，通常不运动，可以通过水源污染或生产过程进入矿泉水，饮用天然矿泉水参考GB 8538-2022，粪链球菌每250毫升均不得检出。利用利用自动菌落计数仪可快速准确检测出矿泉水中是否含有粪链球菌及数量。

方案详情：

1、 实验原理

采用孔径为0.45μm亲水性微孔滤膜,将水中所含的细菌截留在滤膜上,然后将滤膜移至KF链球菌琼脂培养基上,于36 ℃士1℃培养48 h+2h。如果有红色或粉红色菌落生长,需将菌落接种于脑心浸液琼脂培养基上做进一步的确证试验。如果可疑菌落为革兰氏阳性球菌,过氧化氢酶反应为阴性,在脑心浸液液态培养基中45℃±1℃培养48 h+2h,在胆汁液态培养基中36℃±1℃培养3d,均能够生长,则证实粪链球菌的存在,报告每250 mL水样中的粪链球菌数。

二、‌实验准备

1、设配和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

① 无菌滤器。

② 无菌亲水性微孔滤膜:直径47mm,孔径为0.45μm。

③ 过滤设备。

④ 无菌无齿镊子。

⑤ 恒温培养箱:36℃±1℃。

⑥ 显微镜:100x~1000X。

⑦ 冰箱:2 ℃~8 ℃。

⑧ pH计或pH比色管或精密pH试纸。

⑨ 无菌平皿：直径90MM。

⑩ 蠕动泵分液器：fluidot  600D

⑪ 自动菌落计数仪  SHASHIN KAGAKU，PSF-2200

2、培养基和试剂

① 无菌生理盐水。

② 无菌磷酸盐缓冲液。

③ KF链球菌琼脂培养基。

④ 革兰氏染色液。

⑤ 脑心浸液琼脂培养基。

⑥ 3%过氧化氢溶液。

⑦ 脑心浸液液态培养基。

⑧ 胆汁液态培养基。

三、检验程序

1、粪链球菌检验程序如下：

4、 实验步骤

1、水样过滤

用无菌镊子夹取无菌滤膜边缘部分,贴放在已灭菌的滤头上,固定好滤器,将250 mL水样或稀释后的水样(用无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液稀释)通过孔径0.45μm的滤膜过滤。

2、培养

将过滤后的滤膜贴在KF链球菌琼脂培养基平板上,滤膜截留细菌面向上,平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。将平板倒置,36℃±1℃培养48 h±2h。

3、 结果观察与计数

    使用自动菌落计数仪，自动计数可疑菌落,粪链球菌典型菌落在滤膜上呈现大小不等的红色或粉红色。

4、 确证实验

1 从滤膜上按比例挑取10个不同形态的可疑菌落(不足10个则全挑),接种到脑心浸液琼脂培养基平板上,36 ℃士1 ℃培养 24 h~48 h。

2 用接种环从脑心浸液琼脂培养基平板上挑取培养物进行革兰氏染色,镜检观察。

3 用接种环从脑心浸液琼脂培养基平板上挑取培养物到一片清洁的载玻片上,滴加2滴~3滴新鲜配制的 3%过氧化氢到载玻片的涂抹菌处,如果 30s内有气泡发生,则过氧化氢酶反应为阳性,则该菌不属于粪链球菌,确证试验到此即可停止;如果 30s内没有气泡发生,则显示过氧化氢酶反应为阴性,则该菌可视为粪链球菌可疑菌,需继续如下的确证过程。

4 用接种环从脑心浸液琼脂培养基平板上挑取单菌落到脑心浸液液态培养基内,45 ℃士1℃培养 48 h士2 h。同时挑取单菌落到胆汁液态培养基中,36 ℃士1 ℃培养 3 d。

5 若可疑菌落为革兰氏阳性球菌,过氧化氢酶反应阴性,且分别接种至④中的两种培养基中，培养后使两种培养基均变浑浊，则确证为粪链球菌。

五、 结果与报告

粪链球菌菌落数按式(128)计算,报告每250 ml,水样中的粪链球菌菌数,以CFU/250 ml表示;当d值为1,且T值为0时,可报告250 m水样中未检出粪链球菌:

6、 质量控制

  实验室应根据需要设置阳性对照、阴性对照和空白对照,定期对检验过程进行质量控制。宜选用粪肠球菌(Enterococcus fecalis)标准菌株[CMCC(B)32482或等效标准菌株]作为阳性对照菌株,以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)标准菌株[CMCC(B)43201或等效标准菌株]作为阴性对照菌株。