目前,我国畜禽养殖业抗生素滥用现象相当严重。虽然抗生素在提高生产效益上发挥了一定的积极作用,但其所导致的负面效应也越来越引起人们的关注。2006年1月1日,欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖中的使用。面对世界各国逐步禁用抗生素饲料添加剂的趋势,我国对绿色饲用抗生素替代品的需求亟待解决。
发酵炮制中草药有着独特的优势。本研究选用马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香等中草药按比例制成复方,用单因素和正交试验相结合的试验设计最终确定其最佳的发酵工艺,其中,发酵微生物为枯草芽孢杆菌,以复方中草药发酵前后多糖含量变化为检测指标,为饲用抗生素替代品的研制提供参考。
PART.1 材料与设备
菌种:枯草芽孢杆菌
试验原料:中草药、酵母膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、浓硫酸、盐酸、蒽酮及其他试剂均为分析纯
仪器:超净工作台、紫外分光光度计、电热恒温培养箱、可调温水浴锅、超声波提取机、电子天平、电热恒温震荡培养箱、热空气消毒箱。
全钢超净工作台
电热恒温培养箱
可调温水浴锅
电子天平
PART.2 试验方法
●葡萄糖标准曲线的绘制
将样品葡萄糖在105℃烘箱中烘至恒重,使用分析天平称取0.010g于100ml容量瓶中,用蒸馏水定容,摇匀,得到葡萄糖标准溶液。移液枪分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9ml葡萄糖标准溶液至干净具塞试管内,加蒸馏水至1ml。各试管加入硫酸蒽铜溶液(0.1g蒽酮溶于100ml80%浓硫酸中)4ml,沸水中加热10min,冷却至室温。分光光度计在625nm测其吸光度。对所得值进行线性回归,得到回归方程:y=83.93x+0.011,R2=0.998。
●含糖量的测定
中草药在烘箱中烘干后,粉碎,过60目筛,按比例配成27.5g放入250ml三角瓶中用玻璃棒搅拌均匀,在无菌操作台中紫外照射30min。取三角瓶中中草药粉末0.5g放入250ml三角瓶中,加入45ml80%乙醇浸泡30min,超声30min,用加有滤纸的漏斗过滤弃去滤液。过滤后中草药残渣再次放入250ml三角瓶中,重复上述操作1次。将滤渣放入烘箱中烘干,加入2%盐酸,沸水浴1h,冷却至室温后过滤到100ml容量瓶中,重复操作1次,合并滤液,用2%盐酸定容。混匀,取1ml中草药提取液于25ml容量瓶中,用2%盐酸定容,取1ml于具塞试管中,加入4ml硫酸蒽酮溶液,沸水浴10min,凉水冷却至室温,分光光度计625nm下测定吸光度。得到未发酵复方中草药含糖量为10.05%。
●菌种的活化
取适量菌粉于灭菌生理盐水中,在无菌操作台里浸泡24h后,接种到装有枯草芽孢杆菌液体培养基的三角瓶里。放置到电热恒温震荡培养箱,37℃,培养48h。培养两代后,对枯草芽孢杆菌进行平板计数,比较该菌正常活菌数(30亿/g),来决定复壮次数。
●复方中草药的发酵
5种中草药进行粉碎后过60目筛。取复方中草药粉末27.5g入250ml三角瓶,在无菌操作台中紫外灭菌30min,按比例加入菌液、灭菌蒸馏水,用封口膜封好,在设定温度下培养,筛选最适接菌量、料水比、时间、温度,再进行正交试验。
PART.3 实验操作
●料水比对复方中草药发酵的影响
每份称取复方中草药粉末27.5g,入250ml三角瓶,每组3个重复。料水比分别为10.5,10.6,1:0.7,10.8,10.9,1:1,接菌量4%,培养时间72h,培养温度37℃,入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干,粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量,确定最佳料水比。
●接菌量对复方中草药发酵的影响
每份称取复方中草药粉末27.5g,入250ml三角瓶,每组3个重复。接菌量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%,料水比由1.2.5节确定,培养时间72h,培养温度37℃,入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干,粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量,确定最佳发酵接菌量。
●培养时间对复方中草药发酵的影响
每份称取复方中草药粉末27.5g,入250ml三角瓶,每组3个重复。发酵时间分别为24、48、72、96、120、144h,料水比由1.2.5节确定,接菌量由1.2.6节确定,培养温度37℃,入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干,粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2方法测发酵药物的多糖含量,确定最佳发酵时间。
●培养温度对复方中草药发酵的影响
每份称取复方中草药粉末27.5g,入250ml三角瓶,每组3个重复。培养温度为分别为29、31、33、35、37、39℃,料水比由1.2.5节确定,接菌量由1.2.6节确定,时间由1.2.7节确定,入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干,粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测定发酵药物的多糖含量,确定最佳发酵温度。
●正交试验优化复方中草药的发酵条件
在单因素试验条件下确定适合复方中草药发酵接菌量、料水比、温度、时间的最适值,在此基础上进行四因素三水平的正交试验,发酵后放入烘箱中烘干,粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量,确定最佳发酵方案。
PART.4 结果与分析
●料水比对复方中草药发酵的影响
料水比为10.5,10.6时,药物发酵后多糖含量逐渐增加,料水比10.6时多糖含量最高,之后多糖含量随着水分的增加而减少,料水比为1:1时,发酵药物多糖含量下降幅度较大。单因素条件下10.6为药物发酵最佳料水比。
●接菌量对复方中草药发酵的影响
接菌量为2%、4%、6%时发酵后药物多糖含量逐渐升高,接菌量为6%、8%、10%、12%时发酵后药物多糖含量逐渐降低。在单因素条件下6%为药物发酵最佳接菌量。
●时间对复方中草药发酵的影响
培养时间在24~48h范围内,发酵药物多糖含量快速上升,培养时间在48~144h范围内,发酵药物多糖含量逐渐降低。单因素条件下48h为药物发酵最佳时间。
●温度对复方中草药发酵的影响
温度在29~35℃范围内,发酵药物多糖含量逐渐升高,35~39℃范围内药物多糖含量逐渐下降。单因素条件下,35℃为药物发酵最佳温度。
●正交试验优化复方中草药的发酵条件
4个因素对发酵后复方中草药多糖含量影响的主次顺序为:D(温度)>C(时间)>A(料水比)>B(接菌量),可知发酵工艺条件最佳组合为A1B1C2D3。方差分析结果表明D(温度)、C(时间)对发酵试验结果的影响极显著(P0.05)。发酵复方中草药(马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香)的最佳工艺组合为:料水比10.5,接菌量4%,时间48h,温度37℃。此条件下发酵的复方中草药多糖含量为17.98%。
PART.5 仪器介绍
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