共聚焦成像如何助力水稻病菌稻热病研究？

稻热病是最严重的水稻病害。稻热病菌透过分生孢子散播，其分生孢子在植株上萌发后，可形成特化的构造附着器以穿透植物组织，菌丝可经原生质丝在组织间生长蔓延，并再度产生分生孢子，在空气中以气流传播。子囊菌真菌稻热病菌被称为引起稻瘟病的半营养型病原体。稻热病菌感染水稻的叶子、茎和穗，并导致产量严重下降。

为了建立对这种疾病的新的控制方法和开发抗性水稻品种，研究稻热病菌与水稻之间基因间和蛋白质间相互作用的细节。本文中，我们将介绍一个使用CFI Apo Lambda S 40XC 水镜拍摄稻热病菌微分干涉成像（DIC）和共聚焦扫描成像的应用实例，东京农业大学Hiromasa Saitoh 教授研究使用植物病原真菌中差异基因表达鉴定新病原基因。

实验概述

通过对接种水稻子叶的稻瘟病菌分生孢子悬液的进行 RNA-Seq 分析，发现假设的多个效应蛋白基因表达增加，并在接种12 至 24 小时后 (hours post-inoculation , hpi) 达到峰值（随着渗透和扩散逐渐增长），但在36 或 48 hpi 出现下调。在这些效应蛋白基因中，研究人员选择了7 个高表达基因，并制备了相应的稻瘟病菌干扰突变体。其中一个基因突变的菌株表现出低的致病性，该基因被命名为 MoSVP。

为了调查MoSVP 在真菌中表达的时间和位点，稻瘟病菌转染报告质粒（MoSVP::mCherry）,在该质粒中mCherry (红色荧光蛋白) 的基因被插入到MoSVP启动子的下游。作为实验对照组，另一个报告质粒（Rp27p::mCherry），插入在稻瘟病菌核糖体蛋白27基因的下游。每一个转化株的孢子悬浊液在盖玻片上孵育或接种在水稻叶鞘内测的上皮，使用DIC 和共聚焦扫描显微镜对感染相关的形态和mCherry荧光的表达进行观察。

Figure1. 水稻叶鞘接种和样本准备。

Figure2. 表达有MoSVPp::mCherry的水稻瘟病菌的mCherry（红色）和DIC。分生孢子在胚管顶端萌发并发育出附着胞，然后渗透到宿主细胞中并形成侵入性菌丝。通过使用CFI Apo Lambda S 40XC 水镜进行DIC 和荧光观察，发现mCherry 荧光蛋白在玻片孵育18小时后可开始表达，同时接种在水稻叶鞘细胞上的菌丝在接种24小时后可以被观察到。

Figure3. 在MoSVPp::mCherry突变菌株中， mCherry荧光的表达在18或24 hpi后在附着胞有明显的增强，然后表达下降。在Rp27p::mCherry 转化菌株中，mCherry荧光的在观察的时间点内表达量稳定。另外， mCherry 荧光在附着胞、分生孢子和胚芽管（12,18,24 hpi）和入侵的菌丝内（30 hpi）内均表达明显. 因此，该文揭示MoSVP 启动子在稻瘟病菌早期渗透到宿主细胞时被激活，表达在附着胞内。

实验小结

本文制备了一个由 MoSVP 启动子控制的表达mCherry 的稻瘟病菌株，并使用CFI Apo Lambda S 40XC 水镜对其感染相关的形态学进行DIC 和共聚焦观察。 结果证实，MoSVP 表达在稻瘟病菌感染后的早期阶段的附着胞内。

这些结果显示，结合高精度的物镜和共聚焦扫描系统可以清晰的对植物致病真菌的荧光信号的定位和表达时间窗进行可视化。

参考文献RNA-Seq of in planta-expressed Magnaporthe oryzae genes identifies MoSVP as a highly expressed gene required for pathogenicity at the initial stage of infection. Molecular Plant Pathology (2019) 20 (12), 1682-1695.