利用AP-SMALDI质谱成像和nano-HILIC MS揭示曼氏血吸虫感染后仓鼠肝脏鞘糖脂变化
关键词：AP-SMALDI 质谱成像，nano-HILIC MS/MS 纳升亲水作用色谱与串联质谱联用，Glycosphingolipids鞘糖脂，Schistosoma mansoni 曼氏血吸虫，granuloma 肉芽肿
2024年3月11日，德国吉森大学 Bernhard Spengler 教授团队于国际化学权威杂志 Analytical Chemistry 发表题目为“Hepatic Topology of Glycosphingolipids in Schistosoma mansoni-Infected Hamsters”的研究成果。
血吸虫病是一种被忽视的热带传染性寄生虫病，全球感染者2亿多人，主要分布在热带和亚热带地区。血吸虫病的临床表现可分为急性期和慢性期。其中，慢性期更为严重，有可能导致感染者死亡。这一阶段主要是由于虫卵滞留在肝脏和脾脏等器官内引起，肉芽肿是其引发的典型的宿主反应，可导致慢性炎症，伤口过度愈合，甚至导致肝纤维化。曼氏血吸虫虫卵甚至能够动员、整合和储存宿主脂质，从而引起肝脏中性脂质和糖原耗竭。识别和表征免疫反应后参与信号转导的分子对于了解宿主-寄生虫之间的相互作用至关重要。据了解，目前尚未有研究关注宿主与寄生虫卵之间的相互作用以及如何导致肉芽肿形成并产生鞘糖脂（GSLs）反应。然而，GSLs 对信号转导和细胞膜构成至关重要，参与在活化的免疫细胞中形成信号转导所必需的微结构域。因此，开发合适的 GSLs 检测方法对于监测其代谢过程和促进药物及疫苗开发十分有帮助。
为更好地理解宿主与寄生虫之间的相互作用及病理变化，本研究重点聚焦肝脏中鞘糖脂（GSLs）的表征，结合优化的 AP-SMALDI MSI 流程（基质选用 DHAP ） 和 nano HILIC MS/MS 技术对比分析了曼氏血吸虫感染和未感染仓鼠肝脏的 GSLs。
nano-HILIC MS/MS 与 AP-SMALDI MSI 技术相结合，一方面可以描述 GSLs 的结构特征，另一方面能够直观呈现 GSLs 在组织切片中的分布情况。作者对比分析了仅感染雌性蠕虫（不产卵）或未感染曼氏血吸虫仓鼠的肝脏，首先通过 nano HILIC MS/MS 检测中性和酸性 GSLs，创建 GSLs 数据库，并对 nano HILIC MS/MS 数据进行统计分析，结果表明感染和未感染样品间存在显著差异。随后，作者通过优化的 AP-SMALDI MSI 技术获取感染组织中 GSLs 的空间分布信息。AP-SMALDI MSI 的半定量数据与 nano-HILIC MS/MS 的结果高度一致，从而证明 AP-SMALDI MSI 可以对 GSLs 进行局部量化分析。肉芽肿形成过程中 GSLs 的丰度变化预示着 GSLs 与免疫细胞分化之间的一种潜在联系。此外，作者进一步采用 3μm 空间分辨率对肉芽肿进行 AP-SMALDI MSI 检测，有助于解析其超精细结构。
作者采用 nano HILIC MS/MS 检测了从感染曼氏血吸虫仓鼠肝脏中提取的 GSLs，确定了上述 GSLs 的甘油酰胺骨架，并对47种化合物的糖基组成和序列进行了鉴定，共鉴定出60种不同的 GSLs。
为了研究曼氏血吸虫感染后 GSLs 与肉芽肿形成的潜在联系，作者比较了未感染、感染雌雄两性曼氏血吸虫（bs感染）和仅感染一种性别曼氏血吸虫仓鼠（ss感染）肝脏中 GSLs 的相对信号强度。作者首先对获取的数据进行主成分（PCA）分析，根据 GSLs 的种类和信号强度实现了组间分离，这表明曼氏血吸虫感染后 GSLs 发生了变化。对 PCA 载荷的分析表明，GSL 种类对不同类群的分离有显著贡献。对这些 GSLs 种类及其丰度进行统计分析发现感染后所有已鉴定的 GSL 均上调表达，并未观察到 GSLs 下调现象（图1）。出乎意料的是，与未感染的对照组相比，仅感染一种性别曼氏血吸虫的样品中，有6种 GSL 显著上调。
总之，nano-HILIC MS/MS 数据表明，曼氏血吸虫感染后，GSLs 的特性和数量发生了显著变化。接下来，作者通过优化的 AP-SMALDI MSI 流程研究了 GSLs 的局部空间变化，以确定可能与 GSLs 变化相关的组织学特征。
图1. Nano-HILIC MS/MS分析GSL谱。
作者通过 AP-SMALDI MSI 可视化不同处理组仓鼠肝组织切片中曼氏血吸虫感染特异性 GSLs 分布。在正离子模式下，获取了 bs 感染仓鼠肝脏中9种不同糖类组成的25个中性 GSLs 的离子图像，这些物质分别分布在肉芽肿和曼氏血吸虫虫卵所在区域。对其结果进一步分析表明，肉芽肿中的特异性 GSL 调节发生在曼氏血吸虫感染时，为肉芽肿的形成提供了潜在的 GSL 标志物。
图2. AP-SMALDI MSI分析中性GSLs。图a中黄色箭头指示曼氏血吸虫虫卵，橙色圆圈表示肉芽肿。图b中红色通道为Fuc3HexNac6HexCer 20:0;O3/16:0，绿色通道为HexNac2Hex3Cer18:1; O2/16:0，蓝色通道为HexNacHex3Cer18:1;O2/16:0。
在负离子模式下检测酸性 GSLs，获取了 bs 感染样本中5种不同糖组成的32种 GSLs 的离子图像。检测到的酸性 GSLs 包括 NeuGcHex2、NeuAcHex2、NeuGc2Hex2 和 NeuGcHexNacHex2。AP SMALDI MSI 成像显示，酸性 GSLs 主要在肉芽肿内特异性积累，其中分别含 NeuGc 和 NeuAc 的酸性 GSLs 表现出差异（图3）。同时，中性 GSLs 在负离子模式下也被可视化。因此，负离子模式可用于交叉验证在正离子模式下获得的结果。此外，负离子模式还适用于硫酸化 GSLs 的检测，其围绕肉芽肿局部分布。由于硫酸化 GSLs 在组织局部积累，在完整组织分析中浓度可能太低，故其注释仅基于物质的精确质量数。因此，MALDI MSI 和 nano-HILIC MS/MS 的正交优势凸显出来，MALDI MSI 使得局部浓度高而整体浓度低的物质被检测到并且可视化呈现。
图3. 酸性GSLs的AP-SMALDI成像图。图a中黄色箭头指示曼氏血吸虫虫卵，橙色圆圈表示肉芽肿。图b中红色表示的是NeuAcHex2Cer18:1;O2/ 16:0，绿色表示的是NeuGcHex2Cer18:1;O2/16:0，蓝色表示的是SHexCer 18：1;O2/16：0。
为了在分子水平上区分肉芽肿内的其他组织学特征，作者采用了激光聚焦斑点更小的离子源装置，进一步提高了该方法的有效横向分辨率。图4比较了 15μm、10μm 和 3μm 空间分辨率采集的质谱图像。RGB 叠加图像显示红色为 HexCer 20:0;O3/16:0，绿色为肉芽肿标志物 HexNac2Hex3Cer 18:1;O2/16:0，蓝色为血吸虫卵表达的特征分子 PC 38:1。图4所示在 10μm 空间分辨率图像上可以看出 HexCer 20:0;O3/16:0 分布在血吸虫卵周围，15μm 图像则呈现效果稍差，而 3μm 的装置所获取的结果清晰度和分辨效果更好，可信度更高。因此也证明了该实验流程（首次采用 DHAP 基质）可以在细胞水平分辨率追踪 GSLs 的空间位置。
图4. 横向分辨率的提升可定位曼氏血吸虫卵亚结构。
本研究中，作者优化了 AP-SMALDI MSI 和 nano-HILIC MS/MS 方法，揭示了与未感染曼氏血吸虫仓鼠肝脏相比，感染样品中 GSLs 的显著性差异及其整体和局部分布情况。高分辨 AP-SMALDI MSI 结果显示，上调的 GSLs 主要分布在肝脏的曼氏血吸虫卵周围的肉芽肿内。这表明 GSL 拓补结构与肉芽肿的形成有关，可能与免疫细胞的浸润和分化有关。确定的 GSL 种类是否仅仅是肉芽肿形成的标志物，以及它们是否与特定的细胞状态相关并用于细胞间通讯或细胞分化，将是未来纵向研究的问题。将 GSL 空间分布与特定的肉芽肿阶段联系起来对于揭示 GSL 的发育进展以及将 GSL 种类与确定的免疫细胞分化阶段联系起来至关重要。
文献地址：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.3c05846?fig=fig1&ref=pdf
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来源于：科瑞恩特（北京）科技有限公司
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