黄曲霉素已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有二十多种,包括B1、B2、G1、G2、M1等毒素和毒醇,存在于土壤、动植物等中。它属于一类致癌物,是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素主要污染粮油及其制品,各种植物性与动物性食品也能被污染。产毒素的黄曲霉菌很容易在水分含量较高(水分含量低于12%则不能繁殖)的禾谷类作物、油料作物籽实及其加工副产品中寄生繁殖和产生毒素,使其发霉变质,人们通过误食这些食品或其加工副产品,又经消化道吸收毒素进入人体而中毒。2017年10月27日,世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考,黄曲霉毒素在1类致癌物清单。
本文参考GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第三法进行前处理,采用免疫亲和柱净化,高效液相色谱测定,建立了油脂样品中黄曲霉毒素B1的检测方法。在2.0ng/L的加标水平下,黄曲霉毒素B1的加标回收率在88%-97%之间,RSD值小于5%,说明本方法可以满足油脂样品中黄曲霉毒素B1的测定。
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仪器与耗材
1.1仪器
睿科集团V20垂直振荡器
睿科集团Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪
睿科集团Auto EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪
高效液相色谱仪:Agilent 1260高效液相色谱仪,配有荧光检测器
1.2耗材和试剂
耗材
黄曲霉毒素B1免疫亲和柱,3ml-20支/盒,300ng(货号:HC-QHZ-0001)
试剂
纯溶剂:乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(分析纯)
甲醇水溶液(70+30):取甲醇700mL加入300mL水中混合均匀
实验流程
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样品制备:称取5g油样(精确到0.01g)于50mL离心管中,加入20mL提取液(甲醇:水=7:3),使用V20垂直振荡器振荡提取5分钟。然后以6000rpm的转速离心5min,取4mL上清液50mL离心管中,加入23mL0.1%吐温-20的PBS缓冲溶液稀释混匀,待净化。
净化:取全部备用液过柱,用20mL水进行淋洗,用2mL甲醇进行洗脱,收集洗脱液于试管中。
浓缩:洗脱液用Auto EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪在50℃下氮吹至近干,再加1mL初始流动相复溶,涡旋混匀,过0.22µm微孔滤膜,供高效液相色谱测定。
固相萃取方法
图1:黄曲霉毒素B1萃取方法
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检测条件
表-1:高效液相检测条件
色谱柱 | C18柱(2.1×100 mm,1.7 um) |
柱温 | 40 °C |
流速 | 0.3 mL/min |
进样量 | 10 µL |
流动相 | 水:甲醇+乙腈(1:1)=65%:35%等梯度洗脱 |
荧光检测器 | 激发波长365nm,发射波长436nm |
结果与讨论
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为了验证该方法的回收率,本实验向0.4g油样中加入黄曲霉毒素B1标准品进行加标回收验证(添加浓度2ng/L,n=3),数据如表-2所示。加标回收率在88%-97%之间,RSD值控制在5%以内。说明该方法能够很好地运用于油样中黄曲霉毒素B1的测定。
表-2.油脂样品黄曲霉毒素B1加标回收率及RSD值(n=3)
序号 | 化合物 | 回收率(%)样品1 | 回收率(%)样品2 | 回收率(%)样品3 | 平均 回收率(%) | RSD(%) |
1 | 黄曲霉毒素B1 | 88.05 | 96.84 | 91.43 | 90.2 | 4.81 |
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总结
1.免疫亲和柱存储时不能冷冻,柱子最佳回温条件是25度下大约回温30分钟,室温过低、时间太短或太长都会影响免疫亲和柱的活性。
2.由于黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定,因此在实验过程中应避免紫外光和太阳光的照射。
3.固相萃取进行提取液净化前,特别对于偏酸或偏碱性样品,应用PBS缓冲溶液(pH=7.4)进行稀释后上机,否则可能会导致回收率偏低。
4.睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作,可以排除人员操作带来的误差,该设备可实现免疫亲和柱自动脱帽,告别手动脱帽和人员看守的烦恼,快速高效地完成净化过程,六通道同时进行,平行性好,实现高通量处理样品,省时省力,真正为批量检测提供帮助。
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