【飞诺美色谱】5种三磷酸核苷酸单体的IP-RP分离

概述

mRNA 药物生产工艺大致可分为 5 个模块：质粒生产，质粒线性化，体外转录合成反应（IVT），mRNA 纯化，LNP 包封。针对mRNA的批量合成，目前较为高效的方式为体外转录（In Vitro Transcription，IVT）。IVT是一个相对复杂的酶催化过程，在合成mRNA的过程中，除DNA模板外，需加入所需的酶、三磷酸核苷酸及其它相关试剂。

三磷酸核苷酸极性很强，在反相色谱上保留很弱，由于结构非常相似，不能实现良好分离。在本应用中，通过添加离子对试剂来增强三磷酸核苷在C18色谱柱上的保留并改善分离。本文对比了两款分析寡核苷酸专用的C18色谱柱，Biozen Oligo 和Clarity Oligo-RP。 前者采用2.6um核壳颗粒结合生物惰性的Bio-Ti柱硬件；后者为3um全多孔杂化硅胶颗粒。结果表明，两款色谱柱在该色谱条件下均可以将A、G、C、T、U这5种三磷酸核苷酸单体分离。

关键词

三磷酸核苷酸；离子对反相；bioZen oligo；Bio-Ti钛合金；Clarity Oligo

化合物信息

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

超高效液相色谱色谱仪(Waters H-Class)；

3.1.2试剂材料

色谱柱1：Biozen Oligo 2.6um, 4.6*150 mm；

色谱柱2：Clarity Olig- RP 3um，4.6*150mm； 三乙胺，正己胺，磷酸为分析纯，乙腈为HPLC级，屈臣氏蒸馏水

3.2样品前处理方法

供试品溶液：取表一5种化合物原液（100mM）各20uL混合后，用纯水稀释成含各组分2mM的混标。

3.2色谱柱条件

色谱柱1：Biozen Oligo（4.6*150 mm, 2.6μm）；P/N: 00F-4790-E0

色谱柱2：Clarity Olig- RP（4.6*150 mm, 3μm）；P/N: 00F-4441-E0

流动相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸调节pH至7.8）

流动相B：流动相A ：乙腈（1：1）

梯度程序见表2：

流 速：0.8 mL/min；

检测器：260 nm

柱 温：50 ℃；

自动进样器温度：8℃

进样量：1 µL

3.4结果

3.5 实验谱图

3.5 讨论

本实验采用Biozen Oligo 2.6um 和Clarity Olig-RP 3um两款色谱柱对5种三磷酸核苷酸单体进行分离。因为三磷酸核苷酸的亲水性很强，在磷酸盐缓冲体系下的保留偏弱，分离度也不好。在反相离子对条件下可以发现保留明显增强，并且5个单体都可以很好的分离。

Biozen Oligo为2.6um的核壳颗粒，跟3um全多孔硅胶颗粒的Clarity Oligo-RP相比，可以看到峰更加尖锐，柱效和分离度更高； 而后者的保留略强，峰的对称性更好。

反相离子对色谱条件需要在流动相中添加烷基胺类离子对试剂，流动相的pH比较高。 如果是传统的硅胶颗粒C18柱，对寿命会有挑战。 Biozen Oligo 2.6um 和Clarity Olig- RP 3um两款色谱柱均采用杂化硅胶技术，技术，使得色谱柱可以耐受1-12的pH，使得色谱柱经久耐用。

结论

实验结果表明， 实验结果表明， Biozen Oligo 2.6um 和Clarity Olig- RP 3um两款色谱柱可以有效的分离5种三磷酸核苷酸单体。这个方法可以同时分析5种单体，在IVT的原料的质控和检测中，可以节省时间提高效率。