SYNAPT系列高分辨质谱又一力作 | 南开李功玉团队：助力微小差异蛋白构象高效解析
研究背景
蛋白质分子在真实生命条件下的结构和功能特性往往受多种环境因子调控，包括配体分子、缓冲条件以及各种类型翻译后修饰等。作为一种常见的翻译后修饰，蛋白不稳定聚糖修饰，例如糖基化中的唾液酸化修饰，在各种生物过程中发挥着至关重要的作用。
然而，由于天然可变性和环境敏感性，在完整蛋白水平研究唾液酸化修饰的构效关系一直缺乏合适的结构分析手段。
论文简介
近日，南开大学李功玉课题组（研究方向：大分子结构质谱分析）与福州大学李金宇课题组（研究方向：计算化学生物学与药物化学）合作，发展《糖型分辨去折叠离子淌度质谱》方法，利用课题组自主开发的《结构质谱指引下的分子动力学模拟》技术，成功揭示了唾液酸化修饰与糖蛋白构象稳定性之间的复杂关系（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。该研究通过对唾液酸化模式、化学计量学信息及其对构象稳定性影响的综合分析，系统阐明唾液酸化调节蛋白质动态三维结构的分子机制，为蛋白低丰度翻译后修饰结构的快速高效解析提供一种新思路。
该工作是李功玉课题组在《构象分辨质谱分析》领域的应用方法学拓展与深化，通过发展全离子去折叠、非变性离子淌度质谱和全原子分子动力学模拟技术，使构象分辨质谱分析从小肽（Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202314578; Chem. Sci. 2023, 5936-5944; Anal. Chem. 2023, 2221-2228）跨越至大蛋白（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G; Anal. Chem. 2023, 10895-10902; Anal. Chem. 2022, 2142-2153），成功实现微小差异的蛋白动态构象的快速高效分辨分析，有效提高了结构质谱解析气相蛋白动态构象的结构分辨率（Nat. Commun. 2019, 10, 5038），属于化学测量学领域质谱分析方向的前沿研究课题。
研究亮点
开发了一种糖型分辨蛋白构象去折叠策略，通过课题组前期报道的全离子去折叠 (AIU) 与非变性离子淌度质谱 ( Native IM-MS ) 联用技术，实现了对不同糖型蛋白质构象的稳定性快速分析和动态去折叠过程的可视化追踪（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。
通过自主构建的定量分析构象参数，定量揭示唾液酸化对蛋白构象稳定性的调控作用，首次发现唾液酸化可以稳定蛋白质构象，并限制其动态构象转变（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。
将课题组前期（Chem. Sci. 2023, 5936-5944）提出的《结构质谱指引下的分子动力学模拟》新思路，首次拓展至大蛋白（> 80 kDa）结构解析。利用这种独创结构质谱解析平台，课题组近期成功解析蛋白气相去折叠的新型分子机制（Chin. Chem. Lett. 2024, in press），发现富含片层的结构域优先去折叠，并观察到 β-片层到 α-螺旋的动态转变，同时证明 α-螺旋比 β-片层具有更高的稳定性。该方法具有较强的广泛适用性，未来可应用于几乎所有蛋白体系。
研究内容
首先，为了表征不同胎球蛋白的唾液酸化模式，作者进行了基于 EThcD 的自下而上的糖蛋白质组学实验，图 1b 总结了牛胎球蛋白（bFT）和人胎球蛋白（hFT）的位点特异性糖基化模式。值得注意的是，具有两个唾液酸的糖型在 bFT 中占主导地位，而具有一个唾液酸的糖型在 hFT 中最为丰富（图 1c）。
图1. bFT 和 hFT 的糖基化模式
为了探究完整蛋白质结构与特定糖型之间的联系，作者开发了一种糖型分辨去折叠策略，该方法结合了非变性离子淌度质谱（Native IM-MS）与全离子去折叠（AIU）技术。通过优化转移池电压， hFT 的氧鎓离子和主要蛋白形式（电荷状态 12+ 、 13+ 和 14+）都得到了很好的分离，通过糖型分辨去折叠实验确定的糖型也与糖蛋白组分析一致（图 2b）。为了更加直观地比较蛋白质构象，作者为每种糖蛋白生成了 AIU 指纹图谱。实验结果表明，随着唾液酸数量的增加，第二个构象与第三个构象之间的 CCS 值差异逐渐缩小。此外，三唾液酸化的 hFT 具有四个构象，而其他唾液酸形式则具有五个构象，由此说明唾液酸的数量可能与胎球蛋白的构象灵活性有关（图 2c）。
图2. 糖型分辨全离子去折叠可视化图谱
为了进一步阐明唾液酸化诱导的蛋白质结构变化，作者量化了一系列的构象参数，包括 CCS 、 AIU50 等。第一个构象转变（T1）的 AIU50 值随着唾液酸个数增加而升高（图 3b 和 3f），这意味着唾液酸化会稳定糖蛋白结构，作者推测这可能是通过促进唾液酸和蛋白质结构域之间的额外静电相互作用和氢键作用实现的。值得注意的是，在 hFT 的第二个转变（T2）中观察到了相反的趋势，作者推测可能是唾液酸化在一定程度上促进了蛋白质的构象灵活性（图 3f）。之后，作者利用展开曲线来量化去折叠比例，并绘制了关于唾液酸化构象稳定性和动态转换的图谱。通过监测 CCS 变化百分比与碰撞电压的关系，绘制了展开曲线（图 3c 和 3g）。展开曲线显示，随着唾液酸数量的增加，去折叠起始能量逐渐增加，这表明存在明显的依赖唾液酸数量的展开趋势。同时，糖型分辨去折叠策略放大了构象差异， bFT 和 hFT 的 RMSD 分别为 5.9%~20.8% 和 7.7%~20.9% （图 3d 和 3h）。这些发现凸显了基于 AIU 方法在表征由不稳定的聚糖修饰诱导的细微构象变化方面的优势。
图3. 糖型分辨去折叠定量分析胎球蛋白构象稳定性
最后，为了研究唾液酸化与蛋白质结构之间的相互作用，作者使用唾液酸水解酶对 bFT 进行消化，同时通过分子动力学模拟进一步阐明了气相中 Asn99 和 Asn156 唾液酸化对蛋白动态构象变化的影响。唾液酸化与去唾液酸化牛胎球蛋白的 MD 结果都表现出四个构象，且具有可接受的 CCS 误差（图 4d）。唾液酸化亚型（646.8 K）的熔解温度（Tm）高于去唾液酸化亚型（642.1 K），表明唾液酸化有助于维持蛋白质构象（图 4e）。对去折叠中间体中 α-helix 和 β-sheet 结构占比的分析表明，唾液酸化有利于维持 bFT 中二级结构的适当折叠（图 4f）。加热过程中的代表性展开特征（图 4g ）表明唾液酸化聚糖可以包裹并紧实蛋白质结构。综上，作者认为末端唾液酸化稳定了胎球蛋白构象并限制了其动态结构波动。
图4. 唾液酸化对胎球蛋白构象的稳定作用
该研究为深入理解蛋白质不稳定聚糖修饰的结构和功能提供了新的见解，为疾病诊断和治疗提供了新的理论基础。同时，该研究也为开发新的蛋白质结构解析方法提供了新的思路。相关研究成果以“Sialylation-induced stabilization of dynamic glycoprotein conformations unveiled by time-aligned parallel unfolding and glycan releasing mass spectrometry”(《构象分辨质谱助力微小差异蛋白构象高效解析》)为题在线发表于化学领域重要期刊、英国皇家化学会旗舰期刊 Chemical Science 上。
南开大学化学学院 2022 级硕士研究生王雅梅、科研助理贾翼菲以及南通大学刘以畅博士为该文共同一作。李功玉研究员和李金宇教授为本文共同通讯作者。美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授和刘源博士对本项目提供了重要的技术支持。本文主要质谱数据均采集于天津《物质绿色创造与制造海河实验室》结构质谱分析平台。本研究工作获国家重点研发计划、国家高层次人才计划、国家自然科学基金和中央高校基本科研业务费等项目资助。
另附：南开大学李功玉课题组（详细信息请参考课题组主页：李功玉课题组 ( x-mol.com )）常年招聘科研助理和师资博士后，欢迎对大分子结构质谱感兴趣的同仁联系（ligongyu@nankai.edu.cn），重点引进具有有机合成化学、计算化学、细胞生物学和蛋白质组学等背景的相关研究方向人才。
论文信息
Sialylation-induced stabilization of dynamic glycoprotein conformations unveiled by time-aligned parallel unfolding and glycan releasing mass spectrometry
Yifei Jia, Yichang Liu, Yamei Wang, Jinyu Li* and Gongyu Li*
Chem. Sci., 2024
https://doi.org/10.1039/D4SC03672G
作者简介
王雅梅 硕士研究生
南开大学
本文第一作者，2022 年本科毕业于南京师范大学，同年保送至南开大学化学学院攻读硕士学位（导师：李功玉研究员），研究课题主要聚焦疾病相关蛋白的结构质谱解析新方法开发。
本文共同第一作者，2022 年于福州大学获物理化学博士学位（导师：李金宇教授），现任南通大学药学院讲师，研究方向为计算化学生物学与药物化学。
李功玉 研究员
南开大学
本文通讯作者，南开大学化学学院，特聘研究员、博士生导师。国家高层次青年人才计划入选者、国家重点研发计划青年项目首席科学家。2017 年博士毕业于中国科学技术大学化学系，随后在密西根大学和威斯康星大学麦迪逊分校完成博士后研究，于 2021 年 2 月加入南开大学化学学院，研究方向为大分子结构质谱分析。
李金宇 教授
福州大学
本文共同通讯作者，教授、博士生导师，福州大学化学学院院长助理。2011 年于荷兰阿姆斯特丹大学和法国里昂高等师范学院获化学与材料学双硕士，2015 年于德国亚琛工业大学医学院获生物学博士学位，同年于德国于利希研究中心先进模拟研究院从事博士后研究，2016 年加入福州大学化学学院、生物药光动力治疗技术国家地方联合工程研究中心。研究方向为蛋白质计算化学生物学理论方法开发与应用。
本文说明了离子淌度技术在蛋白构象研究中的重要作用。沃特世一直致力于不断开发创新质谱相关技术，如特色离子淌度技术、特色成像技术等，同时以“助力客户成功”为使命，期待更多的用户合作及科学成果！
来源于：沃特世科技（上海）有限公司(Waters)
热门评论
最新资讯
厂商动态
新闻专题
