方案摘要
方案下载| 应用领域 | 制药/生物制药 |
| 检测样本 | 中药材和饮片 |
| 检测项目 | 限度检查>黄曲霉毒素 |
| 参考标准 | 2020版《中国药典》 |
该方法适用于包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药的黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的高效液相色谱检测。样品经提取、真菌毒素固相净化柱和真菌毒素免疫亲和柱双柱净化后，用高效液相色谱串联光化学柱后衍生器和荧光检测器进行定量分析黄曲霉毒素含量。黄曲霉毒素G2、B2在1.5 ~ 600 pg范围内线性关系良好，相关系数R2 ＞ 0.99；黄曲霉毒素G1、B1在5 ~ 2 000 pg范围内线性关系良好，相关系数R2 ＞ 0.99。平均回收率在77.5% ~ 118.9%之间。结果表明，该方法快速准确，回收率高，可最大程度去除杂质干扰，净化样品，可作为包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药中黄曲霉毒素的含量测定方法。
中成药中黄曲霉毒素B族和G族的检测解决方案
关键字：
中成药；高效液相色谱仪；黄曲霉毒素；免疫亲和柱；固相净化柱
介绍：
该方法适用于包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药的黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的高效液相色谱检测。样品经提取、真菌毒素固相净化柱和真菌毒素免疫亲和柱双柱净化后，用高效液相色谱串联光化学柱后衍生器和荧光检测器进行定量分析黄曲霉毒素含量。黄曲霉毒素G2、B2在1.5 ~ 600 pg范围内线性关系良好，相关系数R2 ＞ 0.99；黄曲霉毒素G1、B1在5 ~ 2 000 pg范围内线性关系良好，相关系数R2 ＞ 0.99。平均回收率在77.5% ~ 118.9%之间。结果表明，该方法快速准确，回收率高，可最大程度去除杂质干扰，净化样品，可作为包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药中黄曲霉毒素的含量测定方法。
前言
黄曲霉毒素（aflatoxins）系剧毒物质，能诱发原发性肝癌。黄曲霉毒素不溶于水，耐热性高，一般的水洗、加热炮制等传统中成药制作工艺对其含量影响不大，使用霉变中药材加工饮片及其成药制品极易带入黄曲霉毒素污染。由于中成药成分复杂，含有包括远志、酸枣仁、土鳖虫、蜂蜜、蔗糖在内的多种成分，这对色谱检测起到了很大程度的干扰，单一的净化方式远远不足以将其除掉，难以定性定量分析。本研究建立了一种双重净化的前处理模式，能最大程度地去除复杂成分的干扰，同时使中成药中的毒素得到很好的富集，便于检测。结果表明，该方法在满足操作简单、价格低廉的同时，还能达到低检出限、高稳定性的效果，为中成药中黄曲霉毒素的检测提供一个行之有效的方法。
1. 仪器、耗材
高效液相色谱系统包括：岛津SIL-20A 自动进样器，岛津DGU-20A泵，岛津RF-20A荧光检测器和Labsolutions色谱工作站；Pribolab® MFC226固相净化柱（Pribolab，普瑞邦），Pribolab®黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（Pribolab，普瑞邦）；Pribolab®2000S高速均质器（Pribolab，普瑞邦）；Pribolab®KRC光化学柱后衍生器（Pribolab，普瑞邦）；Pribolab®黄曲霉毒素混合标准品（Pribolab，普瑞邦）。
2. 液相条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（30：10：60）为流动相，流速：1.0 mL·min-1，进样量20 uL；采用柱后光化学衍生法，以荧光检测器检测，激发波长：360 nm，发射波长：450 nm。
3. 标准曲线配制
精密吸取混合对照品溶液（黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的浓度分别为300、1000、300、1 000 ng·mL-1）0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，作为混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液1 mL，置于50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得混合对照品工作液。
4. 方法验证
抽取脑立清丸、乌鸡白凤丸、六味地黄丸、人参养荣丸、人参健脾丸、大黄蛰虫丸、百令胶囊和金水宝胶囊进行方法验证。精密吸取混合标准品溶液25 μL，加标水平为黄曲霉毒素B1、G1 5μg/kg，黄曲霉毒素B2、G2 1.5μg/kg。制备供试品溶液，进液相色谱分析，记录峰面积，计算回收率（见表1）。
表1 8种中成药回收率及精密度
Table 1 Recovery Rate and Precision of Eight Chinese Patent Medicines
项目 | 黄曲霉毒素G2回收率及RSD/% | 黄曲霉毒素G1 回收率及RSD/% | 黄曲霉毒素B2 回收率及RSD/% | 黄曲霉毒素B1 回收率及RSD/% | ||||
脑立清丸 | 78.5 | 3.8 | 90.5 | 6.6 | 98.0 | 4.1 | 97.8 | 6.1 |
77.5 | 81.8 | 90.5 | 109.4 | |||||
83.2 | 93.0 | 92.7 | 99.5 | |||||
乌鸡白凤丸 | 95.4 | 9.1 | 105.6 | 5.8 | 105.9 | 2.9 | 102.5 | 6.3 |
80.2 | 94.5 | 100.0 | 116.1 | |||||
92.7 | 97.3 | 102.3 | 108.2 | |||||
六味地黄丸 | 85.5 | 2.3 | 79.5 | 2.2 | 87.5 | 2.0 | 81.5 | 5.4 |
85.9 | 81.8 | 85.1 | 90.2 | |||||
82.3 | 83.1 | 88.5 | 83.4 | |||||
人参健脾丸 | 100.7 | 2.2 | 109.5 | 2.7 | 105.8 | 4.7 | 118.5 | 3.6 |
105.1 | 109.5 | 110.2 | 114.5 | |||||
103.8 | 104.4 | 100.3 | 110.2 | |||||
人参养荣丸 | 100.0 | 4.5 | 115.5 | 8.7 | 110.2 | 2.5 | 116.8 | 7.8 |
105.7 | 108.1 | 105.8 | 109.6 | |||||
109.4 | 97.0 | 105.4 | 99.8 | |||||
大黄蛰虫丸 | 118.9 | 14.2 | 117.9 | 10.1 | 104.4 | 6.7 | 106.5 | 2.2 |
94.2 | 105.9 | 94.1 | 109.0 | |||||
93.3 | 96.4 | 92.3 | 104.3 | |||||
百令胶囊 | 105.3 | 5.0 | 108.2 | 4.4 | 105.6 | 4.3 | 110.9 | 3.5 |
95.5 | 99.3 | 105.4 | 106.5 | |||||
102.9 | 102.5 | 97.8 | 103.5 | |||||
金水宝胶囊 | 110.3 | 11.1 | 108.9 | 3.7 | 105.3 | 6.7 | 108.5 | 5.1 |
90.0 | 109.5 | 105.8 | 101.6 | |||||
93.6 | 102.4 | 93.7 | 98.2 | |||||
5. 结果分析
本方法主要是采用复合的净化手段，即先过固相净化柱，除去脂肪蛋白类、色素类、添加剂、糖类以及结构相似的香豆素类成分，再用免疫亲和柱进行净化，高特异性吸附黄曲霉毒素，采用专用的淋洗液，达到最佳净化富集效果，通过液相色谱串联光化学衍生器和荧光检测器定性定量分析。该方法操作简单快捷，成本低，重复性好，通用性强，适用于多种中成药中黄曲霉毒素的检测。
6. 配置方案
产品名称 | 规格 | 货号 |
液相色谱柱MycoChrm C18 | 5μm 4.6*150 | 185150 |
黄曲霉毒素总量免疫亲和柱 | 25T（3mL） | IAC-011-3 |
黄曲霉素B1B2G1G2混标 | 1.0µg/mLB1,G1; 0.3µg/mLB2,G2 | STD#1082 |
中药材中黄曲霉毒素* | >10 ppb（高中低） | MRM-A-SF |
泵流操作架 | 亲和柱批量操作 | EQ-RACK 8/12 |
Muti-Prep 2000S 全自动多样品均质器 | —— | MP 2000 |
光化学衍生器KRC | KRC-II |
*此类为自然污染物质，每批次供应量有限，不同批次产品浓度不同。
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文献贡献者
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