亚硫酸氢盐修饰后测序法检测甲基化检测仪器_检测方案

方案摘要

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重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用PCR扩增（引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最hou对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点的甲基化状态。

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配置单

方案详情

实验目的: 亚硫酸氢盐修饰后测序法主要可用来检测甲基化。

实验原理: 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用PCR扩增（引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最hou对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点的甲基化状态。

实验材料 :DNA

试剂、试剂盒

NaOH

苯二酚（氢醌）

亚硫酸氢钠

石蜡油

仪器、耗材

离心管

恒温水浴锅

铝箔纸

实验步骤

1.将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2.加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3. 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

4.10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5. 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6.EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7.加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8.50℃避光水浴16h。

注意事项

避免化学品或外源DNA的污染。

文献贡献者

上海远慕生物科技有限公司

银牌会员丨第11年

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