离子交换层析常见问题及解决方法

泰渡生物科技（苏州）有限公司

2021/06/02 02:22
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1、如何根据工艺需求选择基质合适的离子填料

  • 在捕获阶段，为初步分离富集目的产物，可选择具有高结合载量，适应高流速的大粒径基质，如TOSOH的EC（200μm）和C（100μm）型离子填料。

  • 在中间纯化阶段，为除去大部分杂蛋白，可选择具有高结合载量和高分辨率的中等粒径基质，如TOSOH的M（75或65μm）和S（35μm）型离子填料。

  • 在精细纯化阶段，为获得精纯的样品，可选择具有极高分辨的TSKgel系列柱进行实验。

2、根据蛋白pI选择离子交换填料类型

对于已知等电点蛋白：

如果蛋白在等电点之下最稳定，缓冲液pH≤目的蛋白pI，选择阳离子交换剂。

如果蛋白在等电点之上最稳定，缓冲液pH≥目的蛋白pI，选择阴离子交换剂。

  • 缓冲液pH≥目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阴离子交换填料；

  • 缓冲液pH≥目的蛋白pI 3个单位以上选择强阴离子交换填料；

  • 缓冲液pH≤目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阳离子交换填料； 

  • 缓冲液pH≤目的蛋白pI 3个单位以上选择强阳离子交换填料；

  • 缓冲液中含有较高离子强度时选择复合型离子交换填料，如TOSOH的Toyopearl NH2-750F和 Toyopearl Sulfate-650F填料。

对于未知等电点蛋白：

首先应选择阴离子交换剂，起始平衡液pH8.0；

然后填料再尝试阳离子交换剂，起始平衡液pH6.0。

 

3、加载样品时流穿峰里有未结合目标蛋白

  • 加载样品量过多，超出柱子的动态结合载量，可降低上样量；

  • 上样流速过快，可降低上样流速，增加孵育时间；

  • 柱料被污染，结合能力下降，应对层析柱进行清洗及再生；

  • 缓冲液选择不合适，优化缓冲液pH和离子强度。

 

4、样品未按预期洗脱下来或产量较低

  • 洗脱强度不够，增大洗脱液离子强度；

  • 目标蛋白与柱料结合过于紧密，应调整初始平衡液的pH；

  • 目标蛋白在洗脱过程中发生聚集，沉淀柱上，应优化洗脱条件，保证蛋白稳定性；

  • 目标蛋白与柱料发生非特异性吸附，可适当降低盐离子强度，减少疏水相互作用；

  • 目标蛋白可能被蛋白酶降解，添加适量的蛋白酶抑制剂。

 

 5、样品峰拖尾

  • 错误的初始缓冲液，调整pH和缓冲液离子强度；

  • 样品粘性过大，用初始缓冲液对样品进行稀释；

  • 层析柱装填过于松散或柱床上端被压缩，出现液面，需重新装柱。

 

 6、目标蛋白不能与其他杂质峰分开

  • 错误的初始缓冲液，调整pH和缓冲液离子强度，并保证上样前柱子平衡完全；

  • 洗脱条件不佳，优化洗脱条件，降低流速，调整pH，使用更平缓的梯度；

  • 层析柱分离效果不好，柱效差，检查柱效，确定是否需重新装柱或更换预装柱；

  • 目标蛋白在洗脱时被部分降解，添加适量的蛋白酶抑制剂；

  • 样品粘性过大，用初始缓冲液对样品进行稀释，保证样品浓度在50mg/ml之下；

  • 分离柱顶端或底部死体积过大，使样品混合，将顶部适配器靠近柱床表面，减少柱后管路体积。


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