技术宝典 | 精细化分析外周血免疫细胞亚群应用方案

北京层浪生物科技有限公司

2024/07/02 17:04

Phase.1 局限

免疫细胞亚群检测面临窘境

人体免疫系统在抵御外来侵害，监视异常细胞，维持机体内环境稳定中扮演着至关重要的角色。基于这一核心功能，免疫细胞亚群检测在评估机体免疫状态，辅助筛查和评价多种良恶性疾病及其并发症，以及健康管理等方面，也都发挥着不可或缺的作用。

多参数流式细胞术（multi-parameter flow cytometry，MFC）是免疫细胞亚群检测，评估免疫功能的关键技术。然而，随着近年来临床对疾病监测需求的增加，传统的TBNK检测——仅检测T、B、NK细胞的比例和绝对数，由于检测细胞群体少，功能评估简单，所能反映的免疫细胞信息并不全面，其临床应用的实际效果与预期相差甚远。

Phase.2 破局

精细化分析免疫细胞亚群共识发布

为了应对这一挑战，2023年发布了《基于多参数流式细胞术精细化分析外周血免疫细胞亚群的中国专家共识》^【1】（以下简称“共识”），为免疫细胞功能检测领域带来了重大的概念更新和扩展：

共识建议将原先的T、B、NK淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等常见免疫细胞，以及使用不同标志物组合进一步检测的特征性和功能性常见基础细胞亚群重新定义为“外周血基础免疫细胞亚群”；^【2】

同时，建议在传统TBNK免疫细胞亚群的基础上，增加调节性T细胞（Treg）、树突状细胞（DC）等各类免疫细胞，以及检测其分化发育、功能性和活化状态相关标志物，并进一步分类出来的免疫细胞亚群，定义为“精细化分析外周血免疫细胞亚群”。^【3-5】

多参数精细化分析免疫细胞亚群为临床检测增加了更多参数，获得了更多细胞亚群的信息，在淋巴瘤、肿瘤前驱病变筛查，部分遗传和免疫缺陷性疾病诊断，良恶性疾病的发生、发展及预后评估，免疫治疗和造血干细胞抑制免疫重建中，均发挥了极其重要的作用。

Phase.3 前行

层浪流式&精细化免疫细胞亚群8色方案

共识9^【1】提出，精细化分析免疫细胞亚群建议由8色MFC管完成，其精细化程度与方案根据临床应用需求选择。可以采用多管8色及以上方案或一管超多色方案，精细化亚群比例分别为占上一层亚群的比例。我们依照共识建议的8色多管组合方案中的方案1（表2），使用层浪LongCyte^TM临床型流式细胞仪进行了精细化免疫细胞亚群8色分析，结果如下：

T细胞管

设门策略：

依次设置单个细胞门（single），活细胞门（live），live门内设置T细胞（T cell）门。T cell门内设置CD4+T（T4）、CD8+T（T8）、CD4+CD8+T细胞（DP）细胞门。T、T4、T8细胞中分别CD28+、CD28-细胞群。T、T4、T8、DP中分别设置HLA-DR+CD38^-（DR+38-）、HLA-DR-CD38+（DR-38+）、HLA-DR+CD38+（DR+38+）、HLA-DR-CD38-（DR-38-）细胞群。T8中设置初始 T 细胞（TN ）、中央记忆T 细胞（TCM）、效应记忆T 细胞（TEM）、终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）亚群。

Treg/Th细胞管

设门策略：

依次设置单个细胞门（single）、活细胞门（live）、T细胞门（T cell）、CD4+T细胞门（T4）、调节性T细胞门（Treg），T4、Treg中分析初始 T 细胞（TN ）、中央记忆T 细胞（TCM）、效应记忆T 细胞（TEM）、终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）。T4、TCM、TEM中进一步分析辅助性T细胞（Th）亚群。

DC/单核/NK管

设门策略：

依次设置单个细胞门（single）、活细胞门（live）、T细胞门（T cell）、αβT细胞门（αβT）、γδT细胞门（γδT）、NK细胞门，αβT细胞中设置CD8⁺T细胞（αβT T8）和TRBC1⁺细胞门（αβT TRBC1⁺），γδT细胞中设置TCR Vδ2阳性细胞门（γδT Vδ2）。分析上述各群细胞的CD57⁺、CD279⁺、CD57⁺CD279⁺细胞群，分析γδT和TCRVδ2细胞的CD56⁺、CD56⁺CD57⁺细胞群。

TCR管

设门策略：

依次设置单个细胞门（single）、活细胞门（live）、单个核细胞门（PBMC）、非T非B细胞门（CD3^-CD19^-），非T非B细胞门内设置NK、单核细胞（monocyte）、系别阴性（lin^-）细胞门，NK细胞门内设置CD56和CD16组合表达亚群，单核细胞门内设置经典单核细胞（Mo1）、中间单核细胞（Mo2）、非经典单核细胞（Mo3）亚群，lin-细胞门内设置树突状细胞门（DC），DC内区分浆样树突状细胞（pDC）和髓样树突状细胞（mDC）。

B细胞管

设门策略：

依次设置单个细胞门（single）、活细胞门（live）、单个核细胞门（PBMC）、B 细胞门（B cell）、浆细胞（plasma cell）门，B细胞门内设置 CD27^-B 细胞门、记忆性B细胞门（memory B）、CD5⁺B细胞门，分析B和CD5⁺B 细胞门内kappa、lambda表达，CD27^-B细胞内分析初始B前细胞（pre naiveB）和过渡阶段B细胞（transitional B），memory B中分析浆母细胞（plasmablast）。

使用仪器

层浪生物LongCyte^TM3光14色流式细胞仪

参考文献：

【1】基于多参数流式细胞术精细化分析外周血免疫细胞亚群的中国专家共识.中华预防医学杂志 2023 年11 月第 57 卷第 11 期

【2】中华人民共和国卫生部. WS/T 3602011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南[S].北京:中国标准出版社,2011.

【3】Paul F Ruhle,Rainer Fietkau,etal.Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.Int J Mol Sci.2016 Aug 11;17(8):1316.doi: 10.3390/ijms17081316.

【4】Greg Finak,Marc Langweiler,etal.Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat Rev Immunol.2012 Feb 17;12(3):191-200. doi: 10.1038/nri3158.

【5】Oras A,Quirant Sanchez B,etal.Comprehensive flow cytometric reference intervals ofleukocyte subsets from six study centers across Europe.Clin Exp Immunol. 2020 Dec;202(3):363-378.doi: 10.1111/cei.13491.

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