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基本原理本分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法,主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作,且使用通常的实验设备即可完成。试剂与器材•外周血单个核细胞(参见实验1)•PBS1×和PBS10×(无Ca2+、Mg2+),含0.5mM EDTA•胎牛血清(56℃,30分钟加热灭活)•HCl 1mol/l•Percoll分层液(密度=1.130g/ml,商品)•4g/l台盼蓝染液(溶解在PBS液中)•50ml聚丙烯圆锥管•毛细吸管•移液管(1、2、10ml)•CO2孵箱•超净台•有旋转桶转子装置的离心机•PH计操作步骤所有的操作应该在无菌条件下进行一.不同密度Percoll分层液的配制1. Percoll分层液储备液的制备:取未稀释的Percoll原液(从瓶中取)9ml+1ml PBS 10×(无Ca2+、Mg2+),用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制:取Percoll储备液3.12 ml(前一步配制)+1.88 ml PBS1×(无Ca2+、 Mg2+)3. Percoll分层液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml PBS 1×(无Ca2+、Mg2+)4. Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml PBS 1×(无Ca2+、Mg2+)二.不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液(Ⅱ)(密度=1.069g/ml),后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)2. 20℃,在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟(慢慢增加速度,无制动停转)。三.单核细胞的分离1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度较小的部分)之间的界面中。 (图1)图略(暂时)图1. Percoll非连续性密度梯度离心分离法2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次,4℃,400×g离心5分钟,弃上清液。4. 若需要进一步实验,将细胞重新悬浮于培养基中。5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。(参见第一章第一篇第一节)结果本法回收的细胞中单核细胞占70-100%(存活率应大于90%),淋巴细胞占0-20%,粒细胞占0-5%,红细胞占0-7%,血小板小于0.5%。实验要点1. 为了得到较好的结果,外周血单个核细胞分离后应立即使用。2. 所有操作过程应在18-20℃中进行。3. 仔细覆盖各种Percoll分层液,避免破坏其界面。4. 洗涤分离细胞3次,以除去残存的Percoll分层液和血小板。5. 如果所制备的细胞仍不纯,可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠, 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。
单核细胞增生李斯特菌的 生化血清型有哪些?
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