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近日，世界光子大会公布首届“金燧奖”中国光电仪器品牌榜获奖名单，哈尔滨工业大学仪器学院胡鹏程教授团队研制的“高速超精密激光干涉仪”荣获金奖（排名第一）。在学校青年科学家工作室支持下，谭久彬院士指导的胡鹏程教授团队专注于高速超精密激光干涉仪研发，以解决制约我国高端装备发展和量子化计量基准等前沿研究的“卡脖子”问题。团队突破系列核心测量方法和工程化关键技术，解决了该领域存在的测不准、测不精、测不快的核心难题，共获授权发明专利113项（其中国际专利6项），制定相关标准2项，出版学术著作2部。在此基础上，团队研制了HUE-D/S/X系列高速超精密激光干涉仪并进行小批量生产，经3位院士等专家鉴定，仪器整体技术达到国际先进水平，3项关键技术处于国际领先。团队研究成果先后获得2020年中国计量测试学会科技进步一等奖、2021年中国产学研合作创新奖等。据了解，中国光学工程学会主办的首届“金燧奖”中国光电仪器品牌榜评选活动，旨在面向国家重大战略需求，突出创新主体地位，促进关键核心技术攻关，突破“卡脖子”技术难题，重点评选出我国自主研发、制造、生产的高端光电仪器，为助力我国自主研发的科学仪器抢占科技制高点、树立民族品牌自信、展现自主核心竞争力、开拓国内外应用市场创造新的机遇。首届“金燧奖”评审活动共征集申报项目223个，经过形式审查、交叉评审和线上答辩终评、线上公示等环节，最终遴选出金奖10项、银奖16项、铜奖28项、优秀奖17项。世界光子大会公布首届“金燧奖”中国光电仪器品牌榜获奖名单

高速PCR技术 赵晓光 薛燕 （国家生物医学分析中心 北京 100850） 摘要 PCR技术是现代分子生物学最基础的技术之一，在实现扩增效果的同时如何缩短PCR的实验时间成为实验工作者亟待解决的问题。本文从高速PCR的概念入手，阐述了实现高速PCR 仪器技术的原理、优势，及可能的应用。指出了高速PCR技术的核心在于，不仅要提高PCR仪器的升降温速率，更重要的是提高PCR样品温度与金属样品槽的一致性，从而达到缩短变性，退火，延伸等停留时间的目的，进而大大的缩短PCR时间。同时也指出，高速PCR对提高反应特异性带来的好处等。 关键词 PCR；高速PCR；自适配技术；产物特异性 中图分类号TH77 Rapid PCR Technology Zhao Xiaoguang,Xue Yan (National Center of Biomedical Analysis,Beijing,100850) AbstractPCR technology has been one of the basic and key technologies of Modern Molecular Biology. How to shorten PCR time is a question badly needed to be solved on the premise of PCR amplification effect. In the paper we describe the concept, principle, advantage and application of rapidPCR technology which can highly increase the PCR speed. As addressed in the paper, the Key of rapid PCR is not only to increase the heating and cooling rate of PCR machine, more important, it relays on reducing the temperature difference between the PCR module and sample solution, so that the holding time of denaturation, annealing, elongation could be shorten, and the whole PCR time could be shorten dramatically. While, rapid PCR could also lead to another benefit to improving the specificity of PCR. Key words PCR；rapid PCR；Self-Adapting-Container technology；product specificity 1.PCR仪的温度控制 PCR(Polymerase chain reaction：聚合酶链反应)即是在体外模拟体内DNA复制的过程，用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增[1]。PCR反应通常在热循环仪（DNA扩增仪、PCR仪）中的小型反应管，以10-200 微升的反应量进行。热循环仪对反应管进行加热和冷却，达到每个反应步骤所需的温度。一个常规PCR扩增温度循环：94℃变性保持1分钟；55℃退火保持2分钟；72℃延伸保持2分钟，一个循环持续5分钟。热循环仪的变温方式和性能是PCR技术的核心与关键，直接决定PCR的效率和DNA产物的质量与数量。自1985年Mullis等人发明PCR技术以来，出现多种变温方式的PCR仪[2,3]，哪一种变温方式也难十全十美，目前主要有两种变温方式的PCR仪，一种是AB、伯乐、耶拿、Eppendorf、Biometra等公司的PCR仪所采用的半导体制冷器（peltier：帕尔帖）的PCR仪；另一种是以罗氏和corbett等公司采用专利的离心空气浴PCR仪(由于数量较少，本文暂不讨论)。温度控制的主要参数包括；温度的准确性、均匀性和升降温速度。 采用半导体制冷器[4]的PCR仪利用半导体制冷器既可以加热又可以制冷的特点，经过导热介质金属样品槽，控制PCR样品管的温度。主要特点：金属样品槽（银或铝）热传递速率快、易于自动化（没有机械部件）、体积小、控温简单、稳定可靠、环境影响小。主要缺点是金属样品槽的均匀性不好，大部分产品的温度均匀性只能控制在± 0.3℃左右。近几年这类产品的一个主要突破就是升降温速度的提高，这也是许多厂家喜欢大力宣传的指标，主要原因是关键部件半导体制冷器升降温速度的技术突破，表1是目前几种主要PCR仪的温度指标。其中尤以耶拿SpeedCycler2 PCR仪最为突出，升温速率高达15℃/sec，降温速率10℃/sec，在8-15分钟内即可完成标准的30个PCR循环，创建了高速PCR的业界新标准 。当然高速PCR不仅仅是节约时间，同时也具有应用意义！ 表1. 几款常规PCR仪的主要温度参数 品牌 Analytik Jena ABI Biorad Eppendorf Biometra 型号 SpeedCycler² Veriti 96 Well Fast C1000 Mastercycler pro s Tprofessional 升温速率 最大15℃/s 5 ° C/sec 5℃/s 6 ° C/sec 最大6℃/s 降温速率 最大10℃/s 4.25 ° C/sec 5℃/s 4.5 ° C/sec 最大4.5℃/s 样品槽材质 银质镀金 合金 铝质 蜂巢式 银质 纯银镀金 加热元件 高速Peltier Peltier Peltier Peltier，三组回路技术 Peltier 温度控制范围 4 ° C- 105 ° C 4-99.9℃ 0-100℃ 4-99℃ 3-99℃ 控温准确性 &le ± 0.2℃ ± 0.25℃ ± 0.2℃ ± 0.2℃ ± 0.1℃ 控温均匀性 &le ± 0.3℃at 72℃ 0.5℃ ± 0.4℃ ± 0.3℃at 20-72℃ ± 0.15℃at 55℃ ± 0.25℃at 72℃ ± 0.4℃at 95℃ 2.高速PCR的标准与意义 高速PCR[5]这一概念最早是由在PCR和定量PCR技术领域享有盛誉的快速PCR先驱者、美国犹他大学的Carl Wittwer教授在二十世纪九十年代提出的，他认为在30分钟内完成30个循环的PCR扩增实验，才可称之为高速PCR。现在该定义已经被业界广泛认可接受，成为衡量是否为高速PCR的标准。 众所周知，目前常规PCR仪运行一个完整的PCR实验大约需要1～3小时，一天下来只能做3～4次PCR实验，这对于样品量大或使用者多的实验室来说，安排实验工作就非常不方便，严重影响工作效率。而高速PCR可在8-30分钟内即可完成一个常规PCR实验，大大缩短了PCR实验的时间，别小看这节约下来的几十分钟，一天下来就可以多运行好几轮了。而且缩短PCR反应时间，对医院、生产线产品质量控制、现场检测和应急处理等对时间敏感的场合，更有实用意义。 除了反应速度快外，高速PCR的另一个突出优点是可以提高PCR产物的特异性。影响PCR产物特异性的因素有很多，其中引物和模板的正确配对是最为关键的，而这又与引物的退火温度和时间密切相关。在退火温度一定的条件下，退火时间越短，越有利于提高准确配对的引物-模板的比例，进而提高扩增产物的特异性。由于高速PCR技术能使样品温度在非常短的时间内达到设定温度，所以可以大大缩短退火时间，进而扩增出高特异性的PCR产物。 3.高速PCR仪的原理与关键技术 为什么普通PCR仪的PCR反应需要1～3个小时呢？比如扩增1kb片段的目的基因，常规的PCR程序为：95℃ 预变性2min，95℃ 变性30s，58℃ 退火30s，72℃延伸1min，30个循环后再充分延伸2min。即使不考虑升降温变化所需的时间，单纯计算PCR三个步骤所需的时间，一次循环需2min，30个循环也需要60min。有个问题可能有些人没有想过，为什么变性－退火－延伸的步骤必须停留那么长的时间？缩短一点行不行？主要原因是热量从仪器传递到样品要通过半导体制冷器&rarr 传热介质金属样品槽&rarr 样品管&rarr 样品几个环节，而每个环节的热传递效率都会影响样品的实际温度变化，一般情况下样品的温度变化与加热模块相比会有时间上的滞后。当金属样品槽达到了设定温度时，样品实际温度还远远没有达到设定温度。图1为普通PCR仪金属样品槽温度和样品实际温度之间的差别，从中可以清晰地看出这一现象，当样品槽温度达到设定的50℃时，样品的实际温度还在65℃左右，而15s后，两者的温度还有1.5℃的差别。所以进行常规的PCR时，各步骤的停留时间必须足够的长，以使样品的温度达到设定的温度。 图1 普通PCR仪样品槽温度和样品实际温度之间的差别 所以要实现高速PCR反应，就必须解决两个关键问题，提高PCR仪的变温速率和热传导效率。这要取决于基础器件、材料、技术和方法的突破与创新。仪器方面，最主要的是高速大功率半导体制冷器的技术突破，因为他是PCR仪温度控制的源动力和高速PCR的根本。金属样品槽采用导热性好的银材质，由于银的热传导速率两倍于铝，银槽PCR仪的升降温速度及温度均匀性明显优胜于铝槽，银槽再镀金以避免银被氧化，可以最大幅度地提高银槽的导热效率。选择薄壁PCR管和减少反应体系，也可显著提高PCR管内样品的温度响应时间。在追求PCR速度越来越快的同时，反应体系越来越少也是一大发展趋势，这不仅可以节省样品和试剂用量，还可以加快样品的温度变化，和水壶里的水越少越容易烧开是一个道理。以前PCR反应体系通常为50µ L，后来改进为25或20µ L，现在已经有一些产品的反应体系能降低至5-10µ L，这也是实现高速PCR的一个前提条件。 金属样品槽导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，影响样品槽和样品间的热传递效率。各厂商生产的PCR仪金属样品槽和PCR管也多少有些不同。这也是为什么有些厂家会推荐使用者使用某种特定品牌的样品管的原因。针对这个问题，耶拿公司推出专利的自适配容器技术（SAC：Self-Adapting-Container）。基本思路是让样品管形状适应样品槽的形状，随样品槽的形状而变化。技术关键是采用聚丙烯材料制成管壁仅50µ m极薄且富有弹性的PCR管，在PCR加热过程中，管内空气受热膨胀而对管壁施加压力，管壁就会像皮肤一样紧密贴合在样品槽上，实现无缝接触，如图2所示，使热量能快速穿过极薄的管壁传递到样品上，使样品温度和样品槽温度几乎同步变化，如图3所示，从而可大大缩短PCR循环各步骤的停留时间，把先前的几十秒缩短到几秒，进而实现高速PCR。可能处于专利的考虑，这种PCR管只能在耶拿自己独有的一种低缘紧凑型的银质镀金样品槽上使用，由于这种样品槽的深度仅有5mm，减少了银质镀金样品槽的质量，因而进一步提高了银质镀金样品槽与半导体制冷器之间的温度响应速度。比如说上述的常规PCR程序，如果改用SAC高速PCR技术，可实现变性2s，退火2s，延伸10s，升降温变化速率大于10℃/s，30个循环可以在25min甚至更短的时间内轻松完成。 PCR反应前 PCR反应期间 图2 PCR开始后，自适配样品管壁会紧密贴合在样品槽壁上，实现能量的快速传递 图3 高速PCR过程中，样品温度与加热模块温度几乎保持同步 在此，大家可能会产生一个疑问，高速PCR是否要使用特殊的高速PCR聚合酶？将延伸时间或退火停留时间缩短，是否可保证聚合？众所周知，延伸时间是受扩增产物的长度决定的，大家形成的常规概念是按1kb/min来设定。但实际上，普通Taq酶的扩增效率大约为35-100bp/s，扩增1kb仅需要10s-30s。 因此，如果产物长度在300bp，而且采用热平衡时间很短的高速PCR仪，10s的延伸时间就已足够。问题是常规PCR中，要保证样品温度要在延伸温度下停留10秒，须将模块温度停留30秒以上才能实现，而高速PCR由于保证了样品温度和金属样品槽温度的一致性，因此，将模块温度停留10秒即可。另外，近年来一些公司推出了一些快速的Taq 酶，例如，Bio-rad公司的Ssofast酶, Takara的TaKaRa Z-Taq酶等，这些酶的扩增速度比普通Taq酶快5-10倍，使用这些酶，使用高速PCR仪时，延伸时间可以进一步缩短。 4.结束语 PCR技术在生命科学研究领域是一个非常基础又非常重要的技术，随着各种应用需求越来越多，人们对能拥有一台速度快、样品量小、产物特异性好、试剂无特殊要求、操作简便的PCR仪的要求也越来越强烈，高速PCR技术将在不断地改进创新中成为PCR发展的一个必然趋势。参考文献 [１]黄培堂，俞炜源, PCR 技术原理和应用. 北京: 中国科学技术出版社, 1990：1- 9 [２]张文超.聚合酶链反应（PCR）技术与基因扩增分析仪器（PCR 仪）.生命科学仪器，2005 第3 卷第3 期 [３]章春笋，徐进良.时域式PCR生物芯片中温度动力学研究进展.现代科学仪器，2005（03）：13-17 [４]王南林，吴太虎.半导体制冷与医疗仪器. 医疗卫生装备,2002，6：２８－３０ [５]Wittwer，C.T.et al., in Mullis, K.et al.,(Eds.). The polymerase chain reaction. Birkhauser, Boston(1994)：174-181 [6]高惠兰，方福德.聚合酶链反应技术.现代科学仪器，1993（01）07-10 收稿日期：2011-08-22 作者简介：赵晓光，男，主要研究方向：分析仪器

前言对物体的运动和演化过程进行成像分析是探究物理过程和物理规律的最主要手段。由于人眼能够分辨的最高帧速（即连续图像的刷新速率）约为60帧每秒，最短曝光时间约为十几个毫秒量级，无法有效对一些快速过程进行观察分析。快速过程持续时间极短，且往往不可重复，因此对快速过程的研究需要用到专业的成像工具——高速相机来对快速过程进行记录，再以人眼能够分辨的帧速进行播放，从而实现对一些快速过程的研究。随着高速相机技术的发展，目前已能够实现高达百万帧每秒的图像采集，时间分辨率也达到了亚微秒量级，利用高速相机进行绝大部分快速过程的研究和分析已经“不在话下”。但是，还有一类超高速过程，它的完整持续时间仅为纳秒至数微秒量级，这就需要用到一种新型的高速成像工具——超高速分幅相机。图1 相机成像采集帧速对比产品研发背景超高速分幅相机成像技术是目前进行超高速运动物体和瞬时变化过程研究的唯一成像手段，它的发明一开始主要是为了军事科学领域的应用，例如对炸药爆炸过程、核反应过程进行诊断成像。在过去的几十年里，超高速分幅相机的应用领域局限于某些特定的军工领域，市场需求面较窄，因此，市场上鲜有商品化的超高速分幅相机，为数不多的几家国外供应商也因为这类产品特殊的应用场景，而对中国实施严格禁运。国内的少数几家科研单位能够自己开发研制用于科学实验验证的超高速分幅相机，一方面没有完全实现商业化，另一方面也没有足够的生产能力，因此主要以自用为主。随着近年来科技的进步，各学科的发展都很迅速，各行业各应用领域对超高速成像也有了广泛的需求。生物医学、燃烧学、空气动力学、材料科学、核科学、能源科学等多种学科方向都对超高速成像有着广泛的需求。例如：在能源科学领域：随着能源需求越来越大，国家对新型能源的开发需求日渐增大，核聚变是一种高效且清洁的能源来源，核聚变是目前彻底解决“能源危机”最可行的方案。核聚变目前两个比较可行的技术方案分别是惯性约束核聚变和磁约束核聚变，在这两种核聚变系统中，都需要进行等离子体成像诊断。利用超高速分幅相机对等离子体发展演化过程进高速成像，可以为核聚变研究提供关键的实时观测和数据支持，帮助科学家理解和控制核聚变反应过程，推动核聚变能源技术的发展。在航空航天领域：高速流场测试研究是一项关键的工作，旨在研究和理解空气动力学现象对飞行器的影响，随着航空航天发动机技术的发展，流场速度已从亚音速提高到了超音速乃至超高音速，传统的流场诊断成像方式已难以实现对超高音速流场的测试，超高速分幅相机能够实现流场的超高速成像，可用于超高速流场的变化规律分析和研究。在生物医学领域：研究药物的靶向治疗是生物医学研究中一个非常重要的研究方向。在外界激励源作用下，药物颗粒的运动速度很高，要进行药物颗粒的运动轨迹随激励源的变化关系研究，就需要对药物颗粒运动进行超高速成像从而绘制出药物分子的运动轨迹图。超高速分幅相机可以对药物颗粒的运动过程进行高速成像，从而对药物的靶向治疗控制技术研究研究提供依据。超高速成像技术的应用范围已经由早期比较单一的军事科学领域迅速扩展至能源科学、生物医学、航空航天等关系到民生的各个应用方向。一边是市场需求的日渐旺盛，但另一边是该类产品的进口和贸易却有严格的出口许可限制，特别是在一些核能、军事等敏感行业应用领域严格禁运。为了响应这些应用领域的迫切需求，开发一款参数指标优良、性能可靠、经济成本低的国产化超高速分幅相机十分重要。同时，得益于国家近年来对国产设备仪器的支持力度持续加大，在很多应用领域均鼓励优先选择国产设备，这些国内政策支持和国际贸易政策限制方面的因素，为国产超高速分幅相机产品快速发展提供了基础。产品开发历程超高速分幅相机的工作过程十分复杂，它的基本原理是将一个完整的快速过程利用分光系统在空间上分开，并在时间上分割成许多时间段，相机内部集成的多台相机通过精准的时间延迟控制实现对每个时间段的精准拍摄，从而捕捉到高速变化过程的细节。因此，超高速分幅相机的开发涉及到光学、机械、电气、控制等多种技术的融合。图2 超高速分幅相机原理示意图中智科仪结合自身特点和优势，以及在时间分辨超快成像领域多年的技术积累，组建了一支专业高效的技术团队，持续对超高速分幅相机关键技术进行开发和攻关，团队由经验丰富的光学工程师、机械工程师、电学工程师、工艺工程师组成，分别针对超高速分幅相机的几个核心关键技术问题进行持续研发和迭代优化，致力于将超高速分幅相机产品打造成技术指标先进、可靠性高、操作简单方便的实用化科研仪器，为国内科学家的研究提供得力的实验工具。在长达两年的产品研制过程中，我们先后攻克了超高速分幅相机四大核心技术难题：1、创新性的设计开发了基于孔径分光方案的高精度分幅成像系统，将超高速分幅相机的使用波段扩展至紫外波段，提升了各画幅的强度一致性，彻底解决了传统超高速分幅相机“鬼像”等成像问题；2、开发并优化了相机纳秒门控驱动技术，将超高速分幅相机的时间分辨率提升到了500ps；3、像增强器和图像采集相机之间采用了全新技术的光纤面板耦合方式，并优化了光学耦合工艺，使得图像的均匀性、分辨率等光学指标有了很大提升；4、设计开发了板级多通道同步时序控制器，用于各个通道各画幅间的精准时间同步，同步精度10ps，延迟分辨率10ps，通道间时间抖动小于35ps，提升了超高速分幅相机各画幅之间的时间同步精度，此外，板级同步时序控制器的采用，使得整套超高速分幅相机更加紧凑，将超高速分幅相机的体积和尺寸降低了近一半。我们还在广泛听取客户反馈意见的基础上对软件进行了10余个版本的迭代升级，并增加了许多实用功能，包括简易、精准、可视化的时序控制调节功能、三维视图功能、参数测量功能等，进一步提升了软件的易用性和可操作性。图3 超高速分幅相机软件可视化的时序控制调节功能经过长达两年时间的设计和研发，以及对产品的多次迭代和锤炼，目前，中智科仪已成功开发出最多八个画幅通道的超高速分幅相机，单帧最短曝光时间≤500ns，最小帧间隔≤10ps，各帧之间曝光时间抖动≤35ps，等效帧速≥3亿帧/秒。第一台八画幅超高速分幅相机已于去年12月在西安工厂下线，并交付客户使用。图4 首台套八画幅超高速分幅相机下线前主要研发人员合影留念产品技术创新传统的超高速分幅相机主要有两种技术路径，一种是基于微通道板微带阴极行波选通的分幅相机，它获得的图像分辨率较低，很难用来进行图像分析；另一种是基于半透半反棱镜分光结构的分幅相机，由于分光结构的特点导致系统体积大，且容易因棱镜前后表面的反射而形成“鬼像”，降低成像质量。针对传统分幅相机存在的以上问题，我们的产品进行了以下技术创新：1、创新性的设计了基于多面体反射棱镜的孔径分光光学系统，相对于传统的半透半反棱镜分光结构，孔径分光系统的各画幅强度一致性好，光通量大，各个画幅均为反射成像，从而彻底解决了传统分幅相机棱镜分光系统中常有的“鬼像”问题和不同波段“透反比”不一致导致的各个画幅强度不均匀两大技术问题，同时可将分幅光路的作用波段范围扩展至紫外波段。孔径分光系统也在结构上带来了彻底的革新，使得整个分幅相机集成度更高，系统占面缩小了近一半。2、针对各个画幅间精确的时间同步需求，我们设计开发了多通道同步时序控制器，用于各个通道的各画幅间的精准时间同步，同步精度10ps，延迟分辨率10ps，通道间时间抖动小于35ps。该工作属于国内首创，同步时序控制精度达到国际领先水平，填补了国内相关技术的空白。 图5 八画幅超高速分幅相机各通道画幅均一性在产品结构上，我们采用优化的结构设计，各通道立体布局，各画幅采用相机内核集成，并且对各通道单独设计了3个自由度的调整校准机构，用于各通道各画幅间的偏移、旋转校准。以上结构创新，使得相机更加紧凑、重量更轻、功耗更低，同时对各通道各画幅之间的一致性校准提供了结构保证。图6 八画幅超高速分幅相机内部立体结构布局在开发生产工艺上，我们优化设计的光学耦合工艺，将各个画幅的空间分辨率提高到了28~30lp/mm，显著优于市场上的22~25lp/mm；采用严格的校准技术和工艺，并且通过软件对各个画幅间的强度和增益进行了校准，更好的保证了各个画幅间的强度和增益的一致性，能够更加真实的呈现原始信号。图7 八画幅超高速分幅相机各通道画幅成像分辨率测试我们还从设计、制造工艺以及使用环境等多方面考虑，保证超高速分幅相机产品的可靠性。在设计环节，我们的孔径分光结构大大降低了光学系统的复杂程度，并通过精密装配工艺提高了系统的可靠性，同时，针对超高速分幅相机可能的工作环境，我们进行了电磁屏蔽设计，保证整机的抗电磁干扰能力；在生产制造环节，各个元器件、模组都经过严格考核和筛选，从而保证装配后的整机可靠性；整机装配完成后还会进行严格的各项参数检测、拷机测试、振动测试等来保证设备可靠性。中智科仪还组件了一支素质过硬经验丰富的应用工程师和售后技术服务团队，专门为用户提供包括应用测试、操作培训等售前和售后技术支持和服务，并且响应速度迅速，专业高效，也能针对客户的部分具体功能和使用需求进行个性化定制开发的服务。因此，中智科仪超高速分幅相机产品在产品性能参数、功能特点、技术服务水平、售后服务响应速度等多个方面，均优于国外产品。目前，中智科仪的超高速分幅相机已在核聚变等离子体研究、爆炸过程高速成像和光谱诊断、含能材料冲击波演化过程等多种具体应用场景下为科学家提供服务。展望未来，中智科仪的超高速分幅相机系列产品还可广泛应用于生物医学、燃烧学、空气动力学、材料科学、核科学等多种学科方向，我们用心做好中国自己的科学仪器，为中国的科技进步发光发热，贡献绵薄之力。