薄层色谱板分析

摘要：薄层色谱非常适合于药用植物的分析。由于有大量的参数可供调节以得到不同的色谱结果，薄层色谱具有其它方法所无法比拟的灵活性，这也是它所固有的优点。在另一方面，这些参数缺少标准化的精确规定，导致薄层色谱很难重现。就象现在欧洲药典中所表现的情况那样，现代薄层色谱所具有的良好特征都被广泛忽视。以下这篇文章主要对改进药典方法表述以及单个品种各论进行讨论。对实验的优化和标准化进行详细讨论，以提高方法的重现性。用单个参数的理论探讨和以一些实例来说明现代高效薄层色谱的优点以及薄层色谱方法标准化的必要。主题词：衍生化，薄层记录，高效薄层色谱，方法学，薄层展开，薄层点样，标准化，薄层色谱1、前言传统薄层色谱法被广泛应用于药用植物的分析中，并作为植物药鉴别方法被世界上多数药典收录。薄层色谱一般方法学的描述通常并不详细，并给操作者留有太多的空间。因此用这种方法所得到的结果很值得考虑，有时甚至会难以判断。由于在薄层色谱中影响结果的许多参数被忽视，薄层色谱结果的重现性常常不能令人满意。这是阻碍任何方法现代化的巨大阻力。因此，出现了这样一种论调，认为薄层色谱是一种陈旧过时的技术，应该用更可靠的高效液相色谱或其它色谱技术代替它。但是大家不应忽视薄层色谱具有众多的优点。无论在植物药的鉴别，提取物和最后产品的稳定性测试，还是在生产过程中的进程控制，薄层色谱可将结果用一个图片表现出来的这个优点不可替代。快速的分析和每个样品分析的低成本也是它的优点。一个应用于新的药典各论的现代标准方法是让大家认识和接受薄层色谱是具有竞争力的现代分析方法的基本要求。这篇文章讨论了薄层的基本要素和实际工作中的要求，达到了这个最基本的目标。希望能促进这个建设性议题的讨论。2、薄层色谱在药典中的现状在欧洲药典中，薄层色谱在所有的植物药、大多数提取物以及一些合成药物的各论中作为鉴别的基本手段。对于合成药物来说，似乎有一种趋势，在新增或修订的各论中不再使用薄层色谱作为有关物质检查的方法。虽然与其它药典相比，欧洲药典在薄层色谱的一般方法学部分具有较高的水平，但是仍没有反映在方法学方面的一些技巧以及当前技术所带来的好处。虽然规定只能使用预制薄层板，但是没有明确普通薄层板和高效薄层板之间的差别，也未说明哪种薄层板是首选。缺少薄层色谱一些重要实验细节（如薄层点样、薄层展开和衍生化）的指导性原则，甚至没有提到通过图象分析进行定性分析这一薄层最重要的优点。虽然在一般方法学部分提到薄层色谱可作为定量方法，但是只有两个品种使用薄层色谱进行定量。所有的含量测定都使用高效液相色谱，甚至在鉴别中薄层色谱也被成功地用其它技术替代。如果采用现代薄层色谱技术，可以很容易地改变这种状况。3、关于方法学改进的建议3.1薄层板的材料和特性在70年代末期，Merck研制出了高效薄层板。它具有更小的粒度(5μm)和更窄的粒度分布范围(2-10μm)。与传统薄层板相比，高效薄层板具有更好的均一性，更平整的表面和更高的分离性能。表1比较了两者的差别。（略）假设药典原来用普通薄层板的方法以高效薄层板替代。我们就可以得到具有更好分离度，更少斑点扩散以及更好的板间重现性的结果。瑞士植物化学专业委员会已经在几个方法中确认了这个设想，并在欧洲药典注释中出版。例如，图1比较了苦橘油和甜橘油在两中薄层板上的分离情况。可以得出结论高效薄层板是最好的也是最经济的选择。虽然在各论中不能规定商品的品牌，但是也应引起注意，不同的生产厂家生产的薄层板即使通过了药典试剂章节要求的系统适应性试验，也会明显地影响到某一特定方法结果所得的重现性。（图2）因为很难设计一个实验对薄层板分离可能碰到的所有问题进行评价，在进行方法描述时应对薄层板的生产厂家进行规定，或者在方法中包含一个专门的效能测定实验（系统适应性实验）。这些工作已经要求作为各论的详细技术指导在研究方法时考察并提交给药典。然而似乎并没有规定在完成各论前的方法学考察中实际包含两种材料的薄层板，在方法的确认时也没有考察不同的薄层板材料，除非这些工作已经包含在各论中。这些都应该有一个大家可以接受的法定的要求。3.2薄层点样薄层鉴别都是基于比较薄层比移值（Rf值）。因此分析的质量依赖于样品的正确定位。在定量分析中，点样体积也应规定并可重现。此外，分离质量还取决于点样原点的大小、形状以及斑点均一性。将溶液中的样品转移到薄层板上有接触式和喷雾式两种点样方法。在点状点样时，样品溶液形成“环状色谱”，导致样品在点样原点上的不均匀分布。在展开后，斑点可能展宽或不均匀。当样品溶解于对其溶解性很强的溶剂中时，这种现象更为严重。采用喷雾点样方式可显著提高薄层系统的分离度和检出限。它也可将浓度低的样品以大体积点于薄层板上，同时不影响分离的质量。样品条带状点样，便于色谱的目视。如果这些条带是通过喷雾产生的，在整个条带上的样品的均一性又可得到进一步的提高。这是得到可靠的和可重复的定量分析结果的基础。应该注意，用一个接一个的小点点样所形成的条带或用所谓的浓缩带原点并不能得到那样好的分离度，其比移值小的斑点会受到干扰。（图3B-D）3.3展开薄层色谱的结果（斑点的位置、形状和分离度）依赖于展开缸的类型和饱和程度，如图4所示。因此一个方法只在特定的展开缸中以特定的方式展开才可具有重现性，如不进行调整，在其它系统中很难得到相同的结果。相关的理论我们在其它文章中有详细说明。虽然常常使斑点较未饱和或双槽展开缸扩散大，但经典的饱和步骤（在展开缸或水平展开槽中）可获得最好的重现性。在薄层色谱的展开过程中，展开剂的移动速度不断减小（如图5）。因为采用更小的粒子使薄层板更为紧密从而阻碍了展开剂的运动，高效薄层色谱板只能展开很短的距离。在一个固定的展开槽中，固定其它参数不变，两个成分的分离度不单取决于它们在薄层色谱中的相对位置（比移值），还与溶剂前沿的移动位置（展开距离）有关。图6是两个成分在高效薄层板上的分离度与展开距离之间的关系图，其中假定选择因子（α）为1.5。分离度用公式 Rs=(α-1)(RfN)1/2(1-Rf)/4。 在高效薄层色谱中，当展开距离为5-7cm时可得到最好的分离度，在展开距离为6cm时可得到最大的分离度。在硅胶板上，大多数展开剂需要7-20min展开。在一特定的色谱分离中，比移值应在0.3-0.4最佳。应调整溶剂的比例，使主要成分的位置在此范围之间。这些理论的推测可以很容易地用实验验证。在图7中是甘菊油的高效硅胶薄层分离结果。当展开距离增加时，在图7A中比移值0.4-0.5（箭头所示）的两个斑点的分离度似乎有所增加。但是如果把这些色谱图放大到同一个刻度，两个斑点的相对位置似乎没有变化。分离度仍然在展开距离为6cm时最大。一般来说，随着展开距离的增大，比移值减小。这种现象可能是由于展开剂中的挥发性成分在薄层板上逐渐增加的所引起。同样刻度的相似曲线图也可得出与薄层图相似的结果。

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