台式测序仪

安捷伦科技针对台式测序仪推出靶向序列捕获平台 2012 年 2 月 14 日，佛罗里达州马科岛（基因组生物学和技术，AGBT）- 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）推出SureSelect 靶向序列捕获系统，支持台式测序仪的HaloPlex 靶向序列捕获系统。该产品将于明日在基因组生物学技术进展年会上正式亮相。 独特的HaloPlex 技术完美融合了聚合酶链反应系统的速度和特异性以及基于液相杂交体系的可扩展性和捕获片段大小的灵活性。该实验方案无需文库构建，利用单管操作，从而解决了多重 PCR 由于存在交叉杂交问题而使靶向序列数量受限的问题。该方案使样品制备时间缩短到不到一天，适用于 Illumina MiSeq 台式测序仪以及 HiSeq 和 GAIIx 测序仪。 &ldquo 虽然新一代测序技术使全基因组分析成为可能，但是当我们想要在数量庞大的个体中测定少部分基因时，我们通常会遇到如何富集的问题。&rdquo Hubrecht 研究所基因组生物学首席研究员 Edwin Cuppen 说，&ldquo 对于几个到几十个范围的目标基因捕获，当前的杂交捕获技术有其局限性。HaloPlex 技术很好地填补了这个空白，可以帮助我们实现了在单次反应中捕获 2 至 20 个基因的完整编码序列，而且其在目标序列片段的的测序效率超过 90 %。 &ldquo HaloPlex 富集技术与 Ion Torrent 半导体测序技术联用，这种灵活高效的组合非常适用于高通量的小片段靶向基因重测序。&rdquo Cuppen 博士参与了安捷伦针对Ion Torrent 平台推出的 HaloPlex 技术的早期测试项目。 &ldquo HaloPlex只是我们为进一步巩固 SureSelect市场 领先地位而制定雄心勃勃的产品开发项目的一个例子。&rdquo Olle Ericsson 说道。他是 Halo Genomics 创始人，目前在安捷伦担任 DNA 测序市场总监一职。&ldquo 面世后的短短两年时间内，SureSelect 就已被超过200 篇的重要学术论文引用，在研究领域发挥了重要作用。在台式测序和靶向序列捕获技术通往临床研究的道路中，HaloPlex 这一创新技术使安捷伦成为领跑者。 HaloPlex 是一款定制产品，用户使用免费的在线设计向导（Web Design Wizard），在不到 10 分钟时间内就可完成设计，富集数以千计的目标基因组序列。 安捷伦于 2011 年 12 月收购了位于瑞典乌普萨拉的 Halo Genomics，从而获得了该产品。HaloPlex 技术完美补充了 Agilent SureSelect 靶向序列捕获系统。这项新产品如今也受益于安捷伦强大的研发、生产和分销资源。 要了解更多信息，请访问 www.agilent.com/genomics/ngs。 关于安捷伦科技 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是全球领先的测量公司，同时也是化学分析、生命科学、电子和通信领域的技术领导者。公司的 18,700 名员工为 100 多个国家的客户提供服务。在 2011 财政年度，安捷伦的业务净收入为 66 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn

Monica HEGER供稿 德国哈雷市（Halle）马丁· 路德大学的研究人员已经开发出适用于低通量台式仪器的基因分型测序法，如Life Technologies的Ion Torrent PGM，他们认为，这种方法可以应用到非模式生物的群体研究中，并可能取代常规的方法，如微卫星基因分型法。 并未参与这项研究的美国得克萨斯州AgriLife研究所基因组学和生物信息学主任查尔斯· 约翰逊（Charles Johnson）告诉&ldquo In Sequence&rdquo 说，&ldquo 这真是一种非常明智的方法，并且相当有用&hellip &hellip &rdquo 。 这项名为RESTseq的方法适用于限制性片段测序，于本月初发表在&ldquo PloS One&rdquo 期刊上，其与利用限制性内切酶从大量样本中对准所关注的目标基因组区的其他基因分型测序方法相类似。然而，不同之处在于它采用了两步限制性内切酶切割以减少测序的片段数。在第一步中，该小组采用一种通常能在整个基因组中进行切割的限制性内切酶，产生多个片段。随后，该小组在这些片段上连接了专用于PGM的测序适配器。为减少必须完成的实际测序量，其采用了第二种限制性内切酶，以减少文库大小，从而使PGM测序变得易于进行。 &ldquo 通过采用多种限制性内切酶，我们极大地减少了文库，以便于分析]1000种以上的SNP&rdquo ，马丁· 路德大学生物研究所的研究员和论文资深作者埃卡特· 斯托勒（Eckart Stolle）告诉IS，&ldquo 我们采用条码适配器和合并序列对其进行扩增和测序。&rdquo 斯托勒的团队首次证实，其分别采用TaqI和MseI作为第一种和第二种限制性内切酶，通过在两种蜜蜂样本中的应用，该方法是可重现的。此外，由于限制性内切酶能产生极短的片段，该小组还纳入了一项大小选择步骤，只选择约90个碱基的片段。在PGM 316芯片上对每个文库进行测序，产生了367万和271万reads数，其平均读长分别为83个碱基和86个碱基。 在第一种限制性内切酶进行酶解后，99%的reads启动了正确的三联体。选择第二种酶以减少AT含量，由此研究人员发现，事实上，与蜜蜂基因组约32%的总GC含量相比较，这两个文库拥有更高的GC含量，约为44%。作者表示，&ldquo 这种可能富含编码区的片段在筛选选择性群体模式时是非常可取的&rdquo 。 采用保守性设置，该研究小组发现，72%和77%的reads与基因组明确匹配，且分别以20倍和17倍的覆盖率覆盖了11.06和10.05的巨碱基。 为了检验该方法在无参考序列条件下对基因组的分析能力，研究小组采用两个样本的reads进行了de novo组装，并发现，产生的contig（重叠群）覆盖了71%的参考序列，这证实&ldquo 由于组装计算，de novo方法比基于参考序列的方法产生较少的共识序列，但对于生成高质量的声分析数据仍是可行的。&rdquo 接下来，研究小组证明，该方法可以应用于无参考序列基因组的物种，在几种无刺蜜蜂基因组中进行检验。对此，斯托勒表示，研究小组只查看了一对位点，但展望未来，研究人员计划对更多个体和更多的SNP进行基因分型，&ldquo 甚至希望扩展至整个基因组。&rdquo 此外，斯托勒还说，其希望改进该方法，以便能够产生更少的片段。他说，&ldquo 我们确实希望减少片段的数量，以便您能够以较少量片段终止，从而去完成小规模的基因分型，这与人们处理微卫星相类似。&rdquo 微卫星基因分型取决于产生已知位点的标记引物。斯托勒认为，该技术经济划算且效果良好，但在生物体不具有标记引物的情况下（如其研究小组研究的多个蜜蜂物种），采用按比例减少的迭代RESTseq法似乎更具吸引力，因为该方法不要求具有基因组的先验知识。 &ldquo 即使我们事先并未获得任何信息，只要我们制作了限制性文库，我们就能 （通过其他限制性内切酶酶解）减少文库，然后对其进行测序 。&rdquo 斯托勒说，&ldquo 最终，该方法将逐渐取代微卫星基因分型法。&rdquo 约翰逊说，其有可能对该方法进行检验，其认为该方法是对其他基因分型测序法（如RAD-seq）的&ldquo 很好改进&rdquo 。AgriLife研究所是德克萨斯农工大学体系研究所是德克萨斯农工大学体系内的一个农业和生命科学研究机构，目前进行了大量基因分型的测序研究项目，主要集中于植物基因组。 约翰逊补充说，该方法的一个潜在问题是，其在高度重复的区域进行测序时可能会遇到麻烦。限制性内切酶将 &ldquo 在这些重复区域内造成多个切口&rdquo 。 约翰逊认为，这可能使该方法在植物应用中变得具有挑战性，如棉花和甘蔗，因为这些植物中具有一段很长的重复序列。 约翰逊说，所有基因分型测序方法都可能存在这方面的问题，但研究人员已经获得一种解决办法，即采用甲基化敏感的限制性内切酶，由于这种酶只剪切转录活跃的区域，因而使该过程变得更为容易。约翰逊补充说，也可以在第二次酶解中与RESTseq试验方案一起使用这种酶，这将使其更适用于处理具有重复序列的物种。

胰蛋白酶消化，质谱法轻松鉴定蛋白质，已经是非常成熟的工作流程。即使是刚接触MS的使用者也可以很快掌握。在质谱法鉴定蛋白的工作流程中，蛋白质鉴定是通过使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索来实现的。然而，对于数据库中未列出的蛋白质鉴定需求，或需要进行蛋白质末端序列分析的这两种情况，通常采用更昂贵的高端仪器和更复杂的工作流程，需要熟练的操作员。此外，蛋白质测序仪也通常用作蛋白质末端序列分析的方法，但遇到 N 端封闭的蛋白质，去封闭是必要的。作为样品序列分析前的预处理，预处理效果取决于蛋白质类型，可能效果不佳，对操作人员有一定要求，需要一定程度的技能和经验，这些可能会限制其使用。 近年来，利用MALDI-TOF离子源（ISD：In-Source Decay）中发生的蛋白质碎裂离子，可以分析N末端被封闭或未在数据库中登记的蛋白质序列MS图谱。此外，ISD理论上不受每个样品质量的限制，因此无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质进行测序。结合电泳胶提取蛋白和岛津台式机MALDI-8020，通过N端封闭蛋白的分子量测定和序列分析的例子，让我们来了解下大蛋白分子直接测序技术MALDI-ISD。 将模型样品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在缓冲溶液中进行电泳， 95 °C 下加热 5 分钟，然后在聚丙烯酰胺凝胶（ATTO 12.5 %，预制 e-PAGEL）上进行电泳。所得聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质斑点。使用含有表面活性剂的提取缓冲溶液，我们从凝胶分离的碳酸酐酶的条带中提取蛋白质。使用氯仿/甲醇在提取缓冲溶液中沉淀蛋白质以去除表面活性剂和盐，并使用 MALDI-TOF 质谱仪进行测量。芥子酸用作 MALDI 基质用于蛋白质分子量测量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。 图1、碳酸酐酶电泳图图2、从凝胶中提取的碳酸酐酶MS图（基质芥子酸） 接下来，从25 pmol凝胶蛋白条带中提取碳酸酐酶，与基质DAN混合，MALDI-8020线性模式进一步分析。结果如图3所示，主要检测到c离子（从蛋白质N段产生的片段）质量一致的峰。通过使用免费软件Mass++ TM和蛋白质氨基酸序列比对工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我们对从检测到的峰中获得的氨基酸序列进行了同源性搜索。 图3、MALDI-ISD鉴定结果 鉴定结果显示匹配结果最高的是碳酸酐酶。通过检测到的c离子片段质量和数据库中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我们可以推断出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。 MALDI-8020线性模式MALDI-ISD技术，无需复杂的工作流程，无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质（如本文所述m/z 29030示例）进行N端测序。 该方法在岛津应用专家与美国佛罗里达州立大学、日本爱媛大学高级研究支持中心生物医学分析部、利物浦大学生化与系统生物学系等共同发表的一篇文献中也有应用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝胶的预分馏，实现质谱法鉴定完整蛋白或蛋白复合物。凝胶分离回收14种人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD产生的产物离子鉴定人血清白蛋白N端氨基酸序列。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（参考文献：岛津应用新闻 No.B83J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791