线粒体膜电位检测

原创与否转贴线粒体功能状态和不少疾病的密切相关，线粒体膜电位（MMP）则是反映细胞内线粒体功能状态的重要参数之一。本人整理一下线粒体膜电位测量方法，包括主要测量仪器和常用荧光探针，欢迎补充讨论。常用测量仪器：（1）普通荧光显微镜；（2）激光扫描共聚焦显微镜；（3）流式细胞仪。常用荧光探针：JC-1，DioC6，mitocapture，罗丹明123，TMRM等。JC-1（也称CBIC2(3)）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。JC-1单体可采用488或514nm激光激发，发出绿色荧光波长为529nm左右；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，发出红色波长为590nm。罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。在细胞凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃，Rh123 重新释放出线粒体，从而发出强黄绿色荧光，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) 也是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，单激光激发和单荧光发射峰。可用543nm激光激发，发射橙红色荧光波长在580nm左右。相对其他荧光探针，TMRM具有许多优点如染料在线粒体积累仅源于膜电位变化更；相对毒性更小；和细胞器结合率低；适合做线粒体膜电位的定量分析等。

缺血性脑卒中是人类死亡的主要原因之一，也是全球范围内成人致残的主要原因[1]。2019年我国有缺血性脑卒中患者2 418万例，给我国医疗卫生系统造成巨大负担[2]。缺血后大脑血液供应的中断会引发一系列病理生理改变。尽管恢复脑血流对挽救缺血组织至关重要，但血流恢复可能会进一步加重脑损伤[3]。再灌注损伤的机制包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的突然产生、自噬的激活和细胞因子的释放，其中线粒体功能障碍在介导这些病理生理过程中发挥重要作用[4]。目前，重组组织纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）已被批准应用于缺血性脑卒中的治疗[5]。由于治疗时间窗窄，能够应用rt-PA治疗的患者不足10%[6]。因此，寻找更有效的防治缺血性脑卒中的药物至关重要。 在中医理论中，缺血性脑卒中属于“中风”范畴。补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中的经典方剂，已有数百年的临床应用历史[7-8]。方中以生黄芪为君药，补益元气，旨在气旺则血行，瘀去则络通，对中风之气虚血瘀证有显著疗效。现代药理学研究证实，芒柄花素是黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎[9]、抗氧化[10]、神经保护[11]等作用。但是，水溶性差限制了其在中枢神经系统的应用。通过磺化反应合成的芒柄花素磺酸钠（sodium formononetin-3?-sulphonate，Sul-F）克服了其水溶性差的难题，为其应用于缺血性脑卒中的研究提供了物质基础。 本研究通过建立大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，考察Sul-F对大鼠脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤的改善作用和对线粒体凋亡通路的影响，旨在探讨Sul-F是否通过调控线粒体凋亡通路改善脑I/R损伤。 1 材料 1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠75只，体质量（300±10）g，购自斯贝福（北京）有限公司，许可证号SYXK（冀）2021-006。大鼠饲养于动物房，温度（25±1）℃，相对湿度（50±10）%，昼夜周期为12 h，自由摄食饮水，实验开展前适应性饲养1周。本实验所有操作均严格按照动物伦理要求进行，且经河北中医学院实验动物管理和伦理委员会批准（批准号DWLL202306001）。 1.2 药品与试剂 依达拉奉注射液（国药准字H20080056，批号2109050）购自国瑞药业有限公司；Sul-F（质量分数＞95%，批号160901）由河北国金药业有限责任公司提供；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液（批号1222A23）购自美国Sigma-Aldrich公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液试剂盒（批号MD070823）购自碧云天生物技术有限公司；原位末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）检测试剂盒（批号061223240108）、线粒体膜电位（JC-1）检测试剂盒（批号C2006）购自碧云天生物技术有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒（批号A005-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（批号A001-3）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（批号A003-1）均购自南京建成生物工程研究所；电镜固定液（批号02607-BA）、包埋剂（批号90529-77-4）、醋酸双氧铀（批号H60602624A8）购自SPI公司；无水乙醇（批号100092183）、丙酮（批号10000418）购自国药集团化学试剂有限公司；铜网（批号BZ100205a）购自北京中镜科仪技术有限公司；锇酸（批号18456）购自Ted Pella公司；柠檬酸铅（批号180705-C5382）购自EMS公司；β-actin抗体（批号86e1489）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号35y4418）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号43z8686）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号53j2158）购自Affinity公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（批号20220521）购自北京百奥思科生物科技有限公司；Trizol（批号342430AX）购自艾德莱公司；ExonScript First-Strand Synthesis SuperMix with dsDNase试剂盒（批号231106-A5）购自成都市蓉为基因生物科技有限公司；硅胶线栓（批号230701162）购自长沙迈越生物科技有限公司。 1.3 仪器 JT-12J型全自动脱水机、JB-L5型加热石蜡包埋系统（武汉俊杰电子有限公司）；RM2235型石蜡切片机、UC7型超薄切片机（德国Leica公司）；XS-2100型光学显微镜（NOVEL公司）；ELCIPSE-CI型正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；7800型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；LF-2000型SDS-PAGE电泳系统（北京龙方科技有限公司）；JYO2S型凝胶成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司）；chemiscope 6100型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；272005652型实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪（美国Life Techologies公司）；BeamCyte-1026型流式细胞仪（必达科生物科技有限公司）；680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 动物造模、分组及给药 大鼠I/R损伤模型的建立参照文献方法[12]，大鼠ip 1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，置于加热垫上，保持肛温37 ℃。颈前皮肤备毛，在前正中线做切口，暴露颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远端，夹闭颈内动脉远端颈总动脉近端，将线栓经颈内动脉送入大脑中动脉，推送线栓18～20 mm，缺血2 h后拔出线栓并且结扎端口。再灌注0 h时，选择神经功能评分为1～3分的大鼠，随机分为模型组、依达拉奉（3 mg/kg）[13]组和Sul-F高、低剂量（80、40 mg/kg）组，每组15只。另取15只大鼠仅分离血管不插线栓作为假手术组。分别于再灌注0、12 h尾iv给药（4 mL/kg），假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。再灌注24 h后取材进行后续实验。 2.2 神经功能评分 再灌注0、24 h时，采用盲法对各组大鼠进行Zea-Longa评分[14]：0分，活动基本正常；1分，提起时对侧前爪无法完全伸展；2分，向手术对侧转圈；3分，向手术对侧倾倒；4分，意识丧失。 2.3 TTC染色测定脑梗死体积 大鼠麻醉，断头取脑，?20 ℃冷冻30 min，以1.5～2 mm厚度进行冠状面切片。置于TTC染液玻璃皿中，37 ℃避光孵育30 min，吸出多余的TTC染液，倒入4%多聚甲醛固定过夜，相机拍照后用Image J软件进行分析，记录脑梗死面积（灰白色）及全脑面积（红色），计算脑梗死体积率[15]。 脑梗死体积率＝(脑梗死面积×厚度)/(全脑面积×厚度) 2.4 HE染色观察脑组织病理变化 大鼠麻醉，断头取脑，4%多聚甲醛固定24 h，沉糖1周，石蜡包埋，以4 μm厚度行冠状切片，HE染色后于光学显微镜下进行观察与拍照。 2.5 TUNEL荧光染色观察脑组织细胞凋亡情况 将石蜡切片标本进行脱蜡、复水、抗原修复以及H2O2封闭，按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书进行TUNEL染色，并使用DAPI对细胞核进行复染。封片后置于荧光显微镜下观察与拍照，并计算细胞凋亡率。 细胞凋亡率＝TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数 2.6 JC-1探针检测脑缺血半暗带组织线粒体膜电位情况 取脑缺血半暗带组织，经300目钢网研磨、滤过到60 mm培养皿中，将滤过后的组织悬液转入15 mL新离心管中。加入Hank平衡盐溶液稀释至10 mL，反复吹打30次，冰上静置5 min，取上清液至15 mL新离心管中。滤过2次，滤液经1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入Hank平衡盐溶液重悬，离心后弃上清。加入1 mL Hank平衡盐溶液重悬，细胞计数板计数，并调整细胞密度为1×106个/mL。取200 μL细胞，重悬于0.5 mL细胞培养液中。按照试剂说明书进行染色，流式细胞仪上机检测，以红绿荧光的比值表示线粒体膜电位变化。 2.7 透射电镜观察脑缺血半暗带组织超微结构 取缺血半暗带脑组织，剪成1 mm3小块，经PBS漂洗、4 ℃固定（2.5%戊二醛，12 h）、PBS漂洗、固定（1%锇酸，2 h）、PBS漂洗、丙酮脱水（30%、50%、70%、80%、95%、100%）、渗透包埋（Epon812）、超薄切片、染色（醋酸双氧铀和柠檬酸铅）后，在透射电子显微镜下采集图像分析。 2.8 ELISA检测脑缺血半暗带组织匀浆中MDA水平和SOD、GSH-Px活性 取缺血半暗带脑组织匀浆，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测量吸光度（A）值，并计算MDA水平和SOD、GSH-Px活性。 2.9 qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测脑缺血半暗带组织Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达 取缺血半暗带脑组织，Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。利用逆转录试剂盒Superscript III将RNA反转录成cDNA，加入引物，以β-actin为内参，荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪扩增，采用2???Ct法计算缺血半暗带Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达水平。 图片 2.10 Western blotting检测脑缺血半暗带组织Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达 取缺血半暗带脑组织，加入裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封闭，分别加入Caspase-3、Bcl-2、Bax抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗（1∶20 000），37 ℃孵育1 h。滴加ECL混合液反应4 min后，采用化学发光成像系统显影并对条带灰度值进行分析。 2.11 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，正态分布计量资料以表示，非正态分布计量资料以M（P25～P75）表示。多组间均数比较，服从正态分布与方差齐者，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；不服从正态分布者，采用Kruskal-Wallis检验。 3 结果 3.1 Sul-F对MCAO大鼠神经功能评分的影响 如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组大鼠神经功能评分均显著降低（P＜0.01），Sul-F低剂量组神经功能评分无显著变化；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较，神经功能评分无统计学差异。 图片 3.2 Sul-F对MCAO大鼠脑梗死体积的影响 如图1-A、B所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组大鼠的脑梗死体积率显著降低（P＜0.05）；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较差异无统计学意义。 图片 3.3 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带病理损伤与细胞凋亡的影响 如图1-C所示，假手术组大鼠脑缺血半暗带神经细胞形态结构正常，结构致密，核仁清晰；模型组脑缺血半暗带神经细胞肿胀，空泡增多，细胞核大小不一，形态不规则，核固缩偏于细胞一侧，部分核溶解。与模型组比较，依达拉奉组与Sul-F高剂量组脑缺血半暗带组织病理损伤情况明显改善，Sul-F低剂量组脑缺血半暗带组织病理损伤情况无明显改善。 如图1-D、E所示，与假手术组比较，模型组脑缺血半暗带TUNEL阳性细胞数显著增多（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TUNEL阳性细胞数显著降低（P＜0.01）；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较，TUNEL阳性细胞数无统计学差异。 3.4 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带线粒体膜电位变化的影响 如图2所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血半暗带线粒体膜电位显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组线粒体膜电位显著升高（P＜0.05），两组之间比较无明显差异。 图片 3.5 Sul-F对MCAO大鼠脑组织超微结构的影响 如图3所示，假手术组大鼠脑组织线粒体丰富，分布均匀，线粒体嵴清晰可见，未见明显损伤的线粒体，无典型的线粒体自噬结构。模型组线粒体总体数量减少，线粒体嵴不清晰、水肿，可见典型自噬小体形成。与模型组比较，依达拉奉组线粒体数量增多，大部分线粒体嵴清晰，偶见线粒体自噬结构；Sul-F低剂量组线粒体数量增多，一部分线粒体嵴清晰，另一部分线粒体水肿，可见典型自噬小体形成；Sul-F高剂量组线粒体数量增多，大部分线粒体嵴清晰，偶见线粒体自噬结构。 图片 3.6 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带组织氧化应激水平的影响 如图4所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血半暗带区组织MDA水平显著升高（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），SOD活性显著升高（P＜0.01）；Sul-F高剂量组GSH-Px活性显著升高（P＜0.01）。 图片 3.7 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带组织Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响 如图5所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与依达拉奉组比较，Sul-F高剂量组大鼠缺血半暗带区Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平无显著差异。 图片 如图6所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与依达拉奉组比较，Sul-F高剂量组大鼠缺血半暗带区Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平无显著差异。 图片 4 讨论 缺血性脑卒中占所有脑卒中的80%～85%，具有较高的致死率和致残率[16]。目前，缺血性脑卒中的治疗手段有机械取栓和药物溶栓，以尽快恢复脑血流、挽救缺血脑组织，但复流复氧可能加重脑组织损伤[3,17]。脑I/R损伤会引发一系列的病理反应，如离子失衡、细胞膜通透性改变、能量代谢障碍等，最终触发凋亡程序，引发细胞凋亡。细胞凋亡涉及线粒体通路和死亡受体通路，其中线粒体通路是启动凋亡程序的关键。因此，改善线粒体功能、保护神经元是治疗脑I/R损伤的关键。 正常情况下，线粒体产生的自由基及其清除处于动态平衡，在缺血等应激条件下，ROS生成过多，氧化还原平衡受损线粒体膜脂质过氧化和结构破坏，造成线粒体功能紊乱和氧化应激损伤[17]。SOD与GSH-Px是机体抗氧化酶系统的重要物质，通过清除线粒体ROS来减轻氧化应激损伤。线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）是由三羧酸循环产生的能量传递给电子并经呼吸链传递过程中，将质子从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外所形成的跨膜电位差，MMP的下降是线粒体氧化应激损伤的早期指标[18]。本研究显示，在脑I/R损伤时，脑组织线粒体受损，主要表现有线粒体肿胀变形、线粒体嵴结构不清，可见线粒体自噬小体。同时，线粒体膜电位显著下降，氧化应激反应被激活，MDA含量显著升高，SOD和GSH-Px活力显著降低。 线粒体途径作为细胞凋亡的关键途径，主要受到Bcl-2家族和Caspase家族相关基因的调控。线粒体功能受损产生大量ROS，ROS过度累积会触发线粒体膜通透性转换孔打开，线粒体膜电位下降[19]。Bcl-2家族蛋白通过调节线粒体外膜通透性在细胞内凋亡信号转导中发挥重要作用。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的主要成员，二者通常以异源二聚体的形式存在。MMP升高时，Bcl-2表达上调，抑制细胞色素C释放以维持线粒体平衡，当Bax高表达时，MMP降低，线粒体中的细胞色素C释放入胞质中，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和dATP的协助下生成凋亡复合物，招募并启动Caspase-9，Caspase-9解体形成cleaved Caspase-9并进一步启动Caspase-3，激活下游Caspase级联瀑布，启动线粒体介导的细胞凋亡[20-21]。Caspase-3是Caspase家族中参与细胞凋亡的关键酶，可导致线粒体膜通透性增加、DNA断裂和染色质浓缩，可能是缺血性神经元核降解的关键执行者[17]。本研究中，脑I/R损伤使促凋亡基因Bax表达显著上调，抑凋亡基因Bcl-2表达显著下调，Caspase-3表达显著上调，提示脑I/R损伤时，线粒体介导的细胞凋亡途径启动。 芒柄花素是经典名方补阳还五汤君药黄芪的活性成分之一。体外研究发现，芒柄花素能够抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶1/凋亡诱导因子/蛋白激酶B（poly-adenosine diphosphate ribose polymerase/ apoptosis inducing factor/protein kinase B，PARP1/ AIF/Akt）信号通路减轻糖氧剥夺/复氧复糖条件下HT22小鼠神经元细胞损伤[22]。为提高其水溶性和生物利用度，经磺化反应合成芒柄花素磺酸钠。前期研究证实，Sul-F能够通过血脑屏障、低毒[23-25]。本研究发现，Sul-F能够减低脑I/R损伤大鼠的神经功能评分、降低脑梗死体积、减轻脑缺血半暗带的病理损伤及细胞凋亡，进而改善脑I/R损伤。 线粒体功能障碍是脑缺血再灌注诱导神经元死亡的标志之一[26]，因此机制研究旨在探讨Sul-F对线粒体介导的细胞凋亡途径的影响。结果显示，Sul-F能够降低脑组织氧化应激水平，部分逆转线粒体膜电位的降低，改善线粒体超微结构损伤，调节Bcl-2/Bax平衡，降低Caspase-3表达，进而抑制线粒体凋亡途径，降低细胞凋亡，对脑I/R损伤具有潜在的治疗价值。 本研究以大鼠大脑中动脉栓塞模型模拟脑I/R损伤，结果显示Sul-F干预能够降低脑组织氧化应激水平，部分逆转线粒体膜电位的降低，改善线粒体超微结构损伤，降低细胞凋亡，改善脑梗死体积和神经功能评分。进一步研究发现，Sul-F能够降低Bax表达、升高Bcl-2表达，降低下游Caspase-3表达，抑制线粒体凋亡信号通路。综上，Sul-F通过调控Bcl-2/Bax平衡，降低线粒体介导的细胞凋亡，改善脑缺血再灌注损伤。

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