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1.求助书一本 书名:中国主要经济植物基因组染色体图谱 作 者: 陈瑞阳出 版 社: 科学出版社
植物转基因技术已经成为现代分子生物学研究中的最重要手段。在过去的十几年里,植物转基因技术获得了重大发展,新型和更为有效的转化方法应运而生。尽管如此,农杆菌介导的遗传转化和基因枪法进行的遗传转化仍然是最重要的两种转化方法。农杆菌转化广泛应用于在谷类及双子叶植物。同时,其他转基因技术也迅速发展,如显微注射法、激光微束穿刺法、PEG 法、花粉管通道法、超声波法、阳离子转化法等1][/sup]。常规转基因技术具有很多优点。农杆菌介导的遗传转化成本低,不需要复杂的仪器设备,转化效率高,适用范围广,插入片段大。正因为具有以上优点,农杆菌转化是目前应用最为广泛的转化方法。基因枪法对转化受体要求低,几乎可适用于所有植物物种,方法快速简单;然而基因枪设备要求高,转化成本相对较高,这在一方面限制了基因枪法的使用。同时利用基因枪法获得的转化子通常具有多个转基因拷贝,粒子轰击也常会造成目的片段的断裂失活,转化子出现嵌合体频率高,这些也都在一定程度上限制了基因枪法的使用。其它方法在应用上都存在一定的局限性,或者是操作复杂,或者是适用的物种少。然而不管使用哪种常规方法,都有共同的局限性:1)插入位置的随机性,由于这种随机性的存在,可能导致转化受体发生性状上的改变,如败育,生长不良等等。2)常规的转基因技术多是进行单性状基因的转入,很难将控制多个性状的多个基因同时转入一种作物中,更难将整条复杂代谢途径中的所有基因引入作物中,很难产生新的复杂性状或代谢产物。3)外源基因在转入作物时,往往因整合进内源基因而破坏该内源基因的功能;同时转化的随机性使转入的外源基因受到整合区域上游或下游调控元件的影响,很难进行操控1]。相比之下,植物人工染色体技术具有很多优势:1)植物人工染色体单独成对存在于转化受体,并且稳定遗传给子代,不会影响和破坏其他染色体的结构和功能。2)植物人工染色体采用位点特异重组技术可以将目的基因定点整合到人工染色体的特定位置,不会破坏受体内源基因的功能,也不会受到整合区域上下游的影响。3)植物人工染色体可以承载多个基因,甚至编码复杂代谢网络的众多基因[[url=http://bbs.instrument.com.cn/post.asp?forumid=487&threadid=&postid=&title=&action=&FTTID=1&hasReadRelease=yes#_ENREF_2]2]。正是这些优势的存在,使得植物人工染色体技术当仁不让的成为第三代植物转基因技术,并具有广泛的应用前景。 [size=10pt][1] Barampuram, S. and Zhang, Z.J. (2011). Recent advances in plant transformation. Methods Mol Biol 701, 1-35.[size=10pt][2] Yu, W., Han, F. and Birchler, J.A. (2007). Engineered minichromosomes in plants. Curr Opin Biotechnol 18, 425-31.
植物人工染色体技术具有广泛的应用前景,然而,目前植物人工染色体技术尚处于其发展初期,仍然存在很多问题。首先,植物人工染色体的构建仍然依赖于常规的转基因技术,或者是农杆菌介导的遗传转化,或者是基于基因枪的粒子轰击的遗传转化,这就不可避免的存在常规遗传转化所存在的问题:转化目的片段插入的随机性,这是一个影响人工染色体构建乃至将来应用的一个重要问题。例如起始载体pWY86系列都是随机插入到某一染色体的某一位置,如果染色体组既包含常染色体,也包含B染色体或者附加染色体,那么目的片段的插入可能位于常染色体,亦可能位于其它染色体,到目前为止,还没有办法控制其特异的插入到某一特定染色体上。同样的,目的片段插入到染色体上的位置也是随机的,尚无办法控制其插入到染色体的特定位置,这些都为后续应用造成了一定的问题:首先,如果目的片段插入到常染色体上,并在插入位置发生端粒介导的染色体切割,这样会造成常染色体部分片段的缺失,对于二倍体植物,这种缺失常常是不能忍受的,大多会造成植株的严重发育不良,或者败育。即便是对于多倍体植物,某条常染色体片段的缺失也有可能造成生长性状的改变。固然我们可以筛选那些发生了端粒介导的染色体切割形成了小染色体,同时遗传性状又没有明显改变的植株,但这需要很大的工作量,同时,即使没有可见或可检测的性状改变也并不能表明不存在隐形的对受体植株的不良影响。同时,常染色体通常很大,靠一次或者几次端粒介导的染色体切割很难形成理想的人工小染色体,即切割后形成的人工染色体可能依然很大,不能满足后续应用要求。如果受体材料染色体组存在B染色体,对于构建植物人工染色体无疑是一个好消息,尤其是如果这些B染色体可以稳定遗传。B染色体通常长度较短,不编码任何功能基因,对于植株的生长发育无影响。如果我们的目的片段插入了B染色体并且发生了端粒介导的染色体切割,并且如果发生了切割的B染色体可以在后面的减数分裂中不被湮没,可以稳定的遗传给子代,那么对于研究者来说是一个巨大的好消息。因为通常认为B染色体对于植株是可有可无的,那么即使发生了端粒介导的染色体切割形成了植物人工小染色体也不会对受体植株造成影响,同时,由于B染色体本身长度较小,无功能,其自身性质就决定了它是构建植物人工小染色体的优良载体。但是B染色体较常染色体而言,通常数量少,长度短,如果基于常规遗传转化的随机性而言,目的片段插入到B染色体,并发生端粒介导的染色体切割的概率就小。幸运的是,Yu W等将pWY86质粒成功的导入了玉米的B染色体,并成功观察到了端粒介导的染色体切割的发生1],这为未来利用B染色体组构建植物人工染色体的研究带来了福音。然而,并不是所有植物物种都含有B染色体,并且,通常B染色体会随着减数分裂的进行而随机丢失或者增加1],这些无疑都给利用B染色体组构建植物人工染色体带来了麻烦。利用附加染色体构建植物人工染色体是又一个理想的选择。在自然界,很多物种都有附加系的存在,这些附加系多附加一对外源染色体,这些附加的外源染色体通常不会对植株发育造成影响,一些附加系很容易发生丢失,如黑麦的附加系[[url=http://bbs.instrument.com.cn/post.asp?forumid=487&FTTID=1#_ENREF_2]2],然而有一些附加系具有很好的遗传稳定性,那么这些含有可以稳定遗传的附加系材料就可以成为构建人工染色体的优良载体。例如本研究的受体材料甘蓝型油菜就有很多附加系[[url=http://bbs.instrument.com.cn/post.asp?forumid=487&FTTID=1#_ENREF_3]3],其中一些附加系就具有很好的遗传稳定性[[url=http://bbs.instrument.com.cn/post.asp?forumid=487&FTTID=1#_ENREF_4]4]。如果以这些遗传稳定的附加系作为转化受体,在转基因后代中筛选目的片段定位于附加染色体并且发生了端粒介导的染色体切割的转化株系,就可以利用这些株系作为进一步的转化或者杂交受体,进行位点特异性重组,实现多基因的定点整合,并且不影响转基因植株的遗传稳定性和生长发育等性状。[size=10pt][1] Yu, W., Han, F., Gao, Z., Vega, J.M. and Birchler, J.A. (2007). Construction and behavior of engineered minichromosomes in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 8924-8929.[size=10pt][2] 任正隆[size=10pt]. (1991). 黑麦种质导入小麦及在小麦育种的利用方式[size=10pt]. 中国农业科学 24, 18-25.[size=10pt][3] 戚存扣,[size=10pt], 浦惠明,[size=10pt] and 傅寿仲[size=10pt]. (1995). 甘蓝型油菜[size=10pt]-埃塞俄比亚芥二体附加系植株形态及细胞学鉴定[size=10pt]. 作物学报 21, 717-722.[size=10pt][4] 戚存扣,[size=10pt], 高冠军,[size=10pt], 浦惠明,[size=10pt], 傅寿仲,[size=10pt] and 仲裕泉[size=10pt]. (2000). [font=宋