平板接种仪

大肠菌群平板计数法的常见问题有哪些？1、VRBA培养相关问题（1）所用器皿是否需要灭菌？答：不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌，但要求一定要清洗干净，表面无污渍、无残留。煮沸完成后，取下锥形瓶，用一般常用的卫生纸（软纸）覆盖瓶口，用橡皮筋缠绕，待冷却至适宜温度即可倾注培养基。在倾注培养基时，须点燃酒精灯，稍微灼烧锥形瓶口。（2）如何保持“煮沸2min”？答：可以用电磁炉或电热板进行加热煮沸，在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时，不需要严格按照此要求进行，加热煮沸数秒即可。原因：本培养基很难保持煮沸2min，一旦煮沸，则培养基很快上涌、翻腾，若不调低温度或立刻采取其他措施，则培养基可在数秒内喷涌出来，严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1—2米范围内都是培养基飞溅的范围（实验室危险因子之一）。（3）若培养基未用完，是否可以冷藏起来下次用？答：不可以。4789.28中已规定，固体培养基最多允许熔融1次（指的是经过高压灭菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用）。且VRBA培养基冷却后，再次熔融时非常容易喷涌，若温度控制不当，底部培养基熔融后很快就会发生喷涌（即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象）。（4）倾注完成后是否需要“覆盖一层”？如何覆盖？答：一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中，若检验员初次接触该食品（或食品品类），则有必要在倾注培养基后再覆盖一层（原因是不清楚该样品是否会发生蔓延）。而如此往复测试几次后，若该样品或食品品类均不存在蔓延现象，则以后的实验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延现象，则以后的检验中zuihao都进行覆盖，zuihao是在原培养基已凝固或半凝固（不会发生晃动）时再倾注一层培养基（“一层”是指缓慢倾注培养基至培养基刚好能够覆盖整个平皿）。 2、如何确定培养基上长的是不是大肠菌群？答：建议新手们认真按照标准进行证实试验，此证实试验简单易操作，每一次VRBA上有菌落生长都进行证实试验，如此往复3-4次，对于哪种形态才是大肠菌群已经能够了然于心。3、两个梯度都长了菌，如何选取？答：选取15-150CFU之间的平板（指的是VRBA平板上所有菌落数在此范围），挑取可疑菌落进行证实试验。详细举例说明：若有两个连续梯度的4个平板上菌落数均在15-150之间，则4个平板上的菌落都要挑取进行证实试验，实际操作时，可灵活操作，如：1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123，1:100的两个平板的菌落数分别为16、18，严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取5个可疑菌落、5个典型菌落进行证实试验，如此需要40根GBLB肉汤管。建议使用镍合金接种环（即传统的接种环，而不是一次性塑料接种环），因为VRBA上生长的菌落（无论典型或可疑）大部分长在底层、且菌落一般较大，被培养基覆盖，传统的接种环较细，用以刮去上层培养基较方便，挑取菌落也较方便。 4、如何进行证实试验？菌落选取数量？答：同上所述，建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实试验。每种不同形态都挑取5-10个进行证实试验（若BGLB管足够，建议多挑取几个进行试验）。注意：A.每种可疑菌落挑取5个，每个菌落放入1管GBLB管中；B.“产气者，记为大肠菌群阳性管”，就要求在实验前须认真筛选BGLB管，凡产气的GBLB管应弃去不用。 5、结果如何计算？答：首先，在VRBA培养24h后进行计数，分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群（何为可疑、何为典型？同“2”，检验员多进行几次实验后自然很清楚典型的大肠菌群是何种形态）的数量。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个；其次，进行证实试验，挑取上述可疑和典型大肠菌群各5个（或者全部挑取），假如10个可疑大肠菌群中有3个证实为阳性，6个典型大肠菌群中有5个证实为阳性，则计算方法如下：最终大肠菌群数=经证实的大肠菌群数=可疑大肠菌群经证实的数量+典型大肠菌群经证实的数量=10×（6/10）×10+6×（5/6）×10=110。 6、若平板上很多菌落，最终证实全部为阴性，结果如何计算？答：根据第3条,选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验，若证实全部为阴性，则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落（建议可疑和典型菌落分别挑取10个）进行证实试验，若第二次证实试验均呈阴性，以＜1乘以zuidi稀释度进行计算，如：1:10的平板菌落数分别为120、123，1:100的平板上菌落数分别为16、18，首先挑取1:100的两个平板上的菌落进行证实试验，若全部为阴性，再挑取1:10的两个平板上的菌落进行证实试验，若1:10的平板上的菌落数证实为阴性，则最终计算过程为＜1x10，最终结果为＜10；若1:10的的平板上的菌落有阳性管，则按照第5条进行计算。中国微生物菌种查询网专业为各企事业单位，科研院所，各级学校提供微生物菌种产品查询、购买服务！网站主要提供的产品：质控菌种，标准菌种，中国微生物菌种4万多株，细胞系/株1万多株其中金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌（大肠杆菌），沙门氏菌，黑曲霉，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，链球菌，白色念珠菌，志贺氏菌等为常用菌株。

介绍细胞系生成通常被认为是一个漫长而乏味的过程，需要大量的劳动力和材料投资。在细胞系开发中，尤其是在单克隆抗体和蛋白质治疗剂的生产中，需要具有高活性的单克隆性和稳健的克隆生长。自动细胞分配和细胞计数技术可提高通量，同时减少分配、识别和验证每孔单个细胞是否存在所需的时间和劳动力。本研究比较了使用自动Formulatrix Tempest液体分配器和Brooks Celigo® 成像细胞仪与电动手动移液和手动分析将CHO细胞分配和分析到384孔板的情况。 方法和材料I. 细胞培养为了制备单细胞接种和克隆生长的细胞， CHO-K1YFP细胞在T-25c㎡的烧瓶中用含有10% FBS和1%G418的F-12K培养基进行贴壁培养。细胞在37℃和98%的相对湿度下，置于5%的二氧化碳中培养。为了进行活性研究，将悬浮的CHO（CHOs）细胞培养在125mL的锥形瓶（Corning #430421）中，其中含有30mL CD CHO培养基（Gibco #10743），还添加了20mM GlutaMax（Gibco #35050-061）和1%HT（Gibco #11067）。细胞在37°C和98%相对湿度的8%CO2中置于轨道振动台（130 rpm）上培养。II. 使用Tempest或手动移液器进行单细胞接种用胰蛋白酶-EDTA (0.25%/0.5 mM) 收集表达黄色荧光蛋白 (YFP) 的 CHO-K1 细胞并重新悬浮在培养基中。细胞通过 40 µm 细胞过滤网 (BD Falcon #352340) 传代两次以获得没有聚集体的细胞悬浮液，然后使用血细胞计数器计数并稀释至200个细胞/mL。使用来自Formulatrix的 Tempest或手持式Matrix电子多通道移液器（Thermo Fisher #2231，12通道384均衡器移液器，2-125 µl）接种培养基和细胞。Formulatrix Tempest是一种非接触式的散装试剂分配器，可通过96个单独控制的喷嘴同时分配多达12种独立成分的任何体积。Tempest正在申请专利的微流控阀组利用正排量技术分配离散的液体体积，能够准确无误地分配到96孔、384孔和1536孔板。此外，使用标准移液器吸头作为源储液器可将死体积减少到100微升，是珍贵样品分配的最佳选择。在细胞接种之前，将25µL/孔的培养基分装到384孔板（Corning #3542）。随后以5微升/孔的细胞悬液（每种分配方法n=3）接种。将板离心以收集每个孔底部的细胞，然后孵化直到成像。III. 使用Brooks Celígo S进行单细胞接种成像使用Celígo成像细胞仪对孔板进行处理，以检测每孔单细胞和克隆生长。Brooks Celígo成像细胞仪是一种高速、易用、多通道亮场和荧光成像细胞仪，用于高通量、全孔细胞图像采集和多孔板处理。Celígo提供明 场成像和三通道荧光成像功能，用于可视化和量化烧瓶和6孔至1536孔微孔板中的细胞反应。该系统提供1µm/像素的全分辨率。整个Celígo是为明场和荧光成像而开发的，它结合了专有的光学器件和软件，可以在整个孔板一直到孔板边缘以一致的对比度对细胞进行成像和识别，这样能够识别细胞的位置和面积，而不需要额外的潜在细胞毒性荧光探针。在第0天使用双通道采集应用程序对孔板进行成像，使用荧光图像进行细胞检测，并使用明场图像对单细胞存在进行视觉验证。经过四天的培养期后，在双通道采集应用中再次对平板成像。明场成像用于确认克隆生长。IV. 活性和接种效率取决于Celígo在培养箱中过夜恢复后，比较了两种分配方法之间的活性测量。对于过夜恢复后的活性测定，将CHO细胞制备成细胞悬液，并使用Tempest 或电动移液器以每孔 500 个细胞的浓度移液到 384 孔板（Corning 3542）中。将板温育过夜。将浓度为 5µg/mL (8uM) 的 Hoechst 33342（Life Technologies，#H3570）和 2µg/mL(3uM)的碘化丙啶(PI)（Life Technologies，#P3566）加入孔中并孵育 30 分钟。使用Celígo对板进行成像和分析其活性。数据和结果I. 单细胞接种为了比较手持式电动移液器和Formulatrix Tempest之间细胞的正确分 配，对检测到单个细胞的孔数进行了量化。用电动移液器手动接种36%（3%CV）的单细胞孔板，Tempest接种32%（2%CV）的单细胞孔板（图1）。两种接种方法在单细胞接种中表现相同，无统计学差异（PII. 克隆生长通过在第0天和第4天对单个细胞生长为一个菌落的孔进行视觉跟踪，可以很容易地用Celígo监测克隆生长的比较。图2显示了单个细胞生长成菌落的代表性图像。细胞和菌落都可以在Celígo的明场和荧光通道中看到。这允许对手持电动移液器和Formulatrix Tempest之间的克隆生长进行量化评估，其中91%（6%CV）和91%（4%CV）的单个细胞分别生长成一个菌落（图3）。这些结果表明，两种分配细胞的方法在克隆生长方面没有统计学差异（PIII. Celígo检测活性和接种效率对于两种接种方法，使用CHO-S细胞监测细胞活性。在一夜恢复期内，Tempest接种法的存活率测量值为97.4%（1.1%CV），电动移液器接种法的存活率测量值为98.9%（0.7%CV）（表1）。两种方法在接种后恢复得同样好。与平板上的细胞计数相比，Formulatrix Tempest的重复性更好，CV为10%，而电动手动移液器的CV为17%（表1）。IV. 手动与自动液体分配和孔板分析的对比与手动分配和孔板分析相比，自动化分配和孔板分析过程可大幅提高吞吐量。将细胞手动分配到384孔板大约需要3分钟，并且会受到更大的可变性和人为错误的影响。Tempest可以在大约40秒内将细胞有效地分配到384孔板上，节省了时间并提高了准确性。手动分析孔板以验证单个细胞的存在，这一劳动密集型过程每孔大约需要30秒，或384孔板需要192分钟，而Celigo S在大约7分钟内完成图像采集和分析过程。自动分配和分析384孔板大约需要8分钟，而手动分配和分析大约需要这些步骤可能既费时又费力，并且会大大增加实验费用。将 Formulatrix Tempest 液体分配器与 Brooks CeligoS 成像细胞仪相结合，创建了一个快速、高效和可靠的系统，用于分配和识别具有单细 95%以上的时间。

为有效预防、及时控制和消除食源性疾病的危害，不断完善公共卫生检验技术，提高检测水平,宁波预防医学会于2009年10月20-24日举办了《食源性疾病的微生物检测研究与溯源》培训班。迅数科技应邀做了主题为“平板图象分析技术在食品微生物快速检测中的应用”的技术报告。 　　 　　图：迅数科技代表在微生物溯源与检测培训班做技术交流 　　迅数全自动菌落计数分析仪-迅数G6-仪器原理是首先由仪器获取平板的数字图象，然后由菌落计数软件对平板图象进行分析：利用目标菌落与培养基背景间颜色和亮度的差异信息分析实现对同一平板上所有菌落轮廓的自动识别，自动标记，自动累计计数和菌落形态数字化分析。 　　其“菌落计数模块”1小时轻松处理400个平板的菌落计数和分析报告，在获取保存培养基菌落图片后1秒钟即可得到准确菌落总数(包括细菌、霉菌、酵母菌和乳酸菌) 其“菌落形态分析”功能可辅助实现培养基质量控制检验。其“抑菌圈分析模块”可自动检测培养基平板上任意位置，任意大小的多个抑菌圈并根据测量的准确直径进行抗生素效价换算及β-内酰胺酶类药物(金玉兰酶)添加与否的检验，其“药敏分析”功能可将测得的抑菌圈数据同仪器配套的最新更新抗微生物药物敏感性判断数据库进行比对分析，得出目标菌的耐药分析结果。 　　该报告还详细介绍了迅数G型菌落分析仪对2009年最新颁布的国家食品卫生标准SN/T2098-2008-“食品和化妆品中的菌落计数检测方法-螺旋平板法”)中的“螺旋平板计数”和GB4789-2008食品卫生微生物学检验标准中的“3M Petrifilm细菌总数测试片”等新方法的自动分析支持。