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染色方法 微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色,但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料,有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法,此外还有鉴别细胞各部分结构的(如芽胞、鞭毛、细胞核等)特殊染色法。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。1、单染色法 用一种染色剂对涂片进行染色,简便易行,适于进行微生物的形态观察。在一般情况下,细菌菌体多带负电荷,易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此,常用碱性染料进行单染色,如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料,多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时,必须降低染液的PH值,使其呈现强酸性(低于细菌菌体等电点),让菌体带正电荷,才易于被酸性染料染色。 单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。 染色结果依染料不同而不同: 石碳酸复红染色液:着色快,时间短,菌体呈红色。 美兰染色液:着色慢,时间长,效果清晰,菌体呈兰色。 草酸铵结晶染色液:染色迅速,着色深,菌体呈紫色。2、革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,1884年由丹麦医师Gram创立。 细菌先经碱性染料结晶染色,而经碘液媒染后,用酒精脱色,在一定条件下有的细菌此色不被脱去,有的可被脱去,因此可把细菌分为两大类,前者叫做革兰氏阳性菌(G+),后者为革兰氏阴性菌(G—)。为观察方便,脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色,阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌,以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌,螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别,染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色,阴性菌复合物结合程度底,吸附染料差,易脱色,这是染色反应的主要依据。 另外,阳性菌菌体等电点较阴性菌为低,在相同PH条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料很多,因此不易脱去,阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如,在强碱的条件下进行染色,两类菌吸附碱性染料都多,都可呈正反应;PH很低时,则可都呈负反应。此外,两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致,阳性菌透性小,故不易被脱色,阴性菌透性大,易脱色。所以脱色时间,脱色方法也应严格控制。本文来自检验地带网 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是: 1)涂片固定。 2)草酸铵结晶紫染1分钟。 3)自来水冲洗。 4)加碘液覆盖涂面染1分钟。 5)水洗,用吸水纸吸去水分。 6)加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,30秒后水洗,吸去水分。 7)蕃红梁色液(稀)染10秒钟后,自来水冲洗。干燥,镜检。 染色的结果,革兰氏正反应菌体都呈紫色,负反应菌体都呈红色。
为一种生物染色剂,必须同时满足两个要求:具有鲜艳透明的颜色,而且能与组织细胞相结合。染色剂分子能够显示颜色的基因,称为发色团。主要的发色团有:亚硝基和偶氮基显示的颜色较强,在染色剂中有一个这样的发色团,就可染出颜色。其他的发色团则不是这样,必须有几个发色团,有醌的分子中就有四个发色团,(2个羰基2个烯基)。 大量的合成染料都是由煤焦油蒸馏得到的,它们都是苯的衍生物,所以苯环是合成染料的基础。苯本身是无色的,但其氢原子为某发色团取代后就带有了颜色。含有发色团的苯环化合物,称为色原。 苯+发色团=色原 色原还不能很好地与组织细胞相结合,即使着了色也很容易脱去。因此仅仅具有色原还不能成为染色剂,染色剂分子中还需具备促使染色剂与组织细胞相结合的基因,这样基国在称为助色团。如—NH2 —COOH —OH —SO3H 氨基 羧基 羟基 磺酸基 氨基在溶液中形成阳离子(+),为碱性;其它羟基,羧基和磺酸基皆带阴离子(-)故为酸性。如三硝基甲苯是个色原,它虽有发色团—硝基,但因缺乏助色团,所以没有染色作用,不能称为染料。假如三硝基苯分子中的一个氢原子被羟基置换,则所生成的化合物既具有发色团而又得到了助色团—羟基,这就成了常用的酸性染料苦味酸。 这就可以看出,助色团的作用在于使色原形成盐类,可以在溶液中电离成为带电的离子,这样才能与相应的组织细胞的成份相结合。
染色就是利用染料在组织切片上给与颜色,使其与组织或细胞内的某种成分发生作用,经过透明后通过光谱吸收和折射,使其各种微细结构能显现不同颜色,这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。染色剂与组织细胞相结合而使组织细胞着色的过程与物理和化学作用两者都有关系。 一.染色的物理现象 1.溶解性: 这种染色最典型的例子就是脂肪染色,苏丹类染色剂为脂溶性染料,它可以被脂质溶解,使脂质着色,就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。因此,当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时,染色剂就从溶液中“转移”到脂质中去,而使脂质着色。 2.吸附作用: 较大物体有从周围介质吸附小颗粒到自身的特性。有些染色则是染色剂分子通过渗透和毛细管作用而被吸收或沉淀到组织,细胞的小孔中去而着色的。例如活性炭吸附各种分子,甚至胶质和微生物等较大的颗粒一样。 二.染色的化学反应 酸性染料和碱性染料的染色作用常是对立的,而不是一致的。任何染料均可电离,离解出阳离子或阴离子。酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子;碱性染料中的碱性部分有染色作用的是阳离子,细胞内同时含有酸性和碱性物质,酸性物质与碱性染料中的阳离子相结合,如细胞核(含有核酸)黏液和软骨基质呈酸性部分被盐基性染料苏木素所染、反之碱性物质与酸性染料的阴离子相结合,如细胞浆及其内部的某些颗粒物质被酸性染料伊红所染。染料的颜色基不是在阳离子,就是在阴离子上,这些离子将因组织反应不同而发生化学结合,如显示含铁血黄素的普鲁士兰反应是最典型的例子。但是,大量染色的化学反应并不象铁反应那样明确,实际情况远为复杂。这是因为蛋白质分子是个分子量自几万至几百万的大分子,每个分子中含有很多阳离子和阴离子基因,在等电点时能形成游离的两性离子,如:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/02/200902201138_134240_1643419_3.jpg[/img]P为蛋白质,是具有两性的胶体物质。它呈酸性或碱性与环境的PH值有关,如溶液的PH值小于该蛋白质的等电点则此溶液对该种蛋白质即为酸性,蛋白质就带正电,将被酸性染色剂所着色。反之,溶液的PH值大于蛋白质的等电点,则此溶液对该蛋白质来说即为碱性,蛋白质带负电,将被带有阳离子的染色剂所浸染。在日常工作中,长久固定于甲醛的组织切片,往往染色不良,尤其是核的着色欠佳。这是因为固定液甲醛氧化生成甲酸,组织亦随之变为酸性,所以不易被苏木素所着色,补救的办法是,先用流水冲洗组织块,然后用碱性溶液如稀氨酒精等处理使之中和,恢复正常PH值后再进行染色。大多数染色的原理至今仍未搞清楚。有些可能是物理的,有些可能是化学的,有些则可能两种机制都起作用,正因为人们对染色的原理还没有完全掌握,所以目前还不能很好地运用原理来控制它。在相当程度上要凭借工作经验。因此“染色”成为技术性很强的一项工作。在进行每一种染色方法时,必须注意不断地有意识地去积累经验,从成功与失败中去真正掌握该染色技术。