推荐厂家
暂无
暂无
最近一直在摸索着用高压冷冻和冷冻替代样品制备技术,刚开始做的时候冰晶特别严重,如下图Hela细胞。冰晶已经把细胞超微结构破坏的不行了。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231539_611900_2423894_3.jpg经过很长时间的摸索,得到以下制样方法:1 取样1.1 培养细胞:取适量的细胞悬浮液,低速离心成细胞团,去上清,细胞团呈米糊状,用移液枪取适量细胞,填满Carrier,加入适量冷冻保护液1-Hexadecene,滤纸吸取多余水分,使冷冻保护液液面略高于Carrier(Carrier用丙酮清洗,然后在空气中晾干,用1-Hexadecene浸泡备用)。1.2 小鼠肝脏:从活体上取出的组织,先用锋利的刀片在低温下切成尽可能薄片状,从中挑选合适的部分切下来,然后装入Carrier,加入适量冷冻保护液1-Hexadecene,滤纸吸取多余水分,使冷冻保护液液面略高于Carrier。2高压冷冻高压冷冻仪在使用前,要先做一些准备工作:要先加入足够的液氮,并加入压力液甲基环己烷,然后用空载的carrier高压冷冻三次,保证高压冷冻仪在最佳工作状态。2.1 将上述装有样品的carrier快速安置到高压冷冻仪,准备高压冷冻。2.2 高压冷冻样品,迅速把样品冷冻下来,并做好记录。通过高压冷冻仪冷冻样品后产生的冷冻速度和压力变化曲线,可以选择冷冻效果较好的样品继续下面实验。2.3 转移样品,首先把现配的替代液1%锇酸(0.5g锇酸溶于50mL丙酮)分装到2mL冻存管中,迅速放入液氮冷冻备用,冷冻过程中保持冷冻管直立。与此同时,冷冻替代仪加满液氮,将自制的冻存管架放入样品腔,预冷至-100℃。用预冷的镊子,在液氮下将Carrier分别装入冻存管,冻存管盖不宜拧的过紧,然后迅速转移到冷冻替代仪样品腔室的冻存管架里。3 冷冻替代 步骤 温度 时间 1 -100℃ -90℃ 4h 2 -90℃ 72h 3 -90℃ -60℃ 8h 4 -60℃ 8h 5 -60℃ -30℃ 4h 6 -30℃ 8h 7 -30℃ -20℃ 2h 8 -20℃ 8h 9 -20℃ 4℃ 2h 10 4℃ 1h 温度达到4℃后,用4℃的丙酮浸洗样品3次,每次15分钟。此过程中,会有部分样品与Carrier分离,若还有没分离的可以用解剖针将样品从Carrier中剥离。4 渗透包埋分别用以下渗透液渗透。 步骤 渗透液 浓度 时间 1 Epon812/丙酮 1:1 1.5-2h 2 Epon812/丙酮 3:1 6-12h 3 Epon812 100% 1h 4 Epon812 100% 8h 5 Epon812 100% 1h然后将样品转移至包埋槽,60℃烘箱聚合48h。5 超薄切片把两种生物样品对应的每一个包埋块分别超薄切片,各捞两个铜网,并染色。6 电镜观察观察细胞内超微结构保存情况,对感兴趣区域拍照。终于有所改善,如下图的小鼠肝脏细胞,轮廓十分清楚,结构保存完好。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231516_611895_2423894_3.jpg局部放大后观察,能看见核孔,双层核膜,甚至是膜的磷脂双分子层结构(这是在常规化学固定制样中很难看到的),看到这些让人激动不已。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231516_611894_2423894_3.jpg碰巧看见一个正在分裂的线粒体。线粒体脊很清楚,双层膜紧挨着,不像常规制样间隙那么大。另外,线粒体基质保存完好,所以线粒体整体较细胞基质反差大。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231516_611893_2423894_3.jpg以下是常规化学固定制样的结果,可与上面高压冷冻及冷冻替代制样技术结果对比:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231644_611928_2423894_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609
[font=&]测PBDE阻燃剂,采集的组织样品立即放入-80度冰箱了,一般流程先化冻打浆再冷冻干燥。有其他省时方法么,或者直接湿重称量做实验,但不了解湿重要与什么物质混合在一起研磨呢??[/font]
生物实验室冰箱要求 冷藏冷冻一体 带显示温度功能 能否用家用冰箱尼 求告知