单细胞

单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况，尤其对于基因通路上表达变化的检测为不利。近期苏伊士理工大学使用FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。1. Live-Seq测序技术简述由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，该团队先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，该团队采用了先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够很快与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。图1. Live-Seq技术a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指代液面；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态为了证实Live-Seq的有效性，该团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态a. 实验方法示意图，使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理；b. 前500个高度易变基因的tSNE图；c. 前十的细胞型、细胞状态差别基因的热图；d. 小鼠基因图谱预测，使用前100个标记基因的团簇；e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析，显示两者没有显著差异。3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响Live-Seq技术的显著优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。图3. Live-Seq对细胞活力的影响a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因（共12个）；d.不同时间点的细胞形态图片。4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验发现，Live-seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达为相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析a. 实验示意图；b. 不同处理细胞的mCherry强度变化；c. 3~7.5h之间mCherry强度变化；d.Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型；e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的表达关系；f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系；g. Live-Seq测序中细胞处于S期的评分；h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化；i.Tnf-mCherry的荧光强度增量（3~7.5h）。5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。图5. Live-Seq对细胞的多次提取j.连续测序的示意图和代表图像；k.Live-Seq的tSNE图；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。 6. 总结Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。 参考文献：[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752 DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

单细胞测序：少量细胞和稀有细胞的解决方案做单细胞测序的时，您是否遇到下列情况： ü 细胞样本量较少，不够做一次高通量单细胞测序… … ü 没有简便易用的设备分选单个细胞… … ü 保护细胞的基因完整性难度大… … ü 分选到单细胞后，找不到合适的试剂进行下一步操作… … 如果这些问题曾给您带来困扰，4月28日由Namocell联合Qiagen带来的关于“少量细胞和稀有细胞的单细胞测序解决方案”的讲座，一定会让您有所收获。 近年来的单细胞研究表明，生物体由数千种独特且不可重复的细胞类型组成。由于单细胞中核酸数量有限，使用二代测序（NGS）方法进行单细胞分析（类似于低样本量测序）传统上具有挑战性。当研究群体较小时，这种限制变得更加明显，例如稀有细胞样本（阳性细胞占比0.1%以下）。高保真度（HiFi）和高质量的DNA扩增对于单细胞测序至关重要，这在很大程度上取决于分离细胞的质量。因此，用于分离单个细胞的方法对于确保细胞活力和核酸完整性至关重要。 美国Namocell公司专利的轻柔分选和细胞富集技术为您克服上述挑战，为单细胞测序提供了更高数量和质量的细胞样本，让您能够轻松获得细胞样品的完整且准确的遗传信息。 无论您是单细胞分析的初学者还是专家，相信都能在这个信息丰富的网络研讨会中有所收获。让我们一起了解和探讨少量样本和稀有单细胞测序的重要因素和新技术。 会议时间2022.4.28 16:00-17:00（注册时选择观看时间为Thursday, April 28, 2022, 10:00 AM CEST） 报名通道（点击） 主讲人介绍

p 　　近期，中科普瑞整合IsoTex-BD China单细胞研究联合实验室经过近一年的研发测试和应用，正式投入科研服务应用。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/92a657b0-670f-473c-bf67-1ada9534cb59.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 469" height=" 310" style=" width: 469px height: 310px " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " BD(China)—Sinotech Genomics(中科普瑞)单细胞研究联合实验室 /span /strong /p p 　　中科普瑞自2018年3月BD(中国)-云泰生物单细胞研究联合实验室成立以来，联合实验室完成了多项技术研发测试，已获得了数百例肿瘤组织的单细胞全转录组测序数据，并针对性设计靶向panel进行验证，完成合作研发项目五十余项。 /p p 　　单细胞测序技术在2018年继续飞速发展，各类相关技术和应用纷纷上线，与此同时， strong 单细胞水平转录组与蛋白质组的检测，也逐渐广泛应用于免疫、癌症和干细胞等研究领域。 /strong BD公司旗下的单细胞平台—BD Rhapsody作为单细胞研究应用领域的利器，既可通过单细胞全转录组和靶向转录组测序的整合策略，在单细胞水平构建从新靶标发现到多样本验证的完整研究体系，又可利用其最新的BD& reg AbSeq assay检测单细胞水平的蛋白表达，实现特异高效的转录组和蛋白组的多组学研究方案。 /p p 　　 strong 为了更好地聚焦单细胞肿瘤临床研究应用，中科普瑞携其下属科研服务子公司—上海鲸舟基因推出单细胞研究系统解决方案。 /strong 立足于BD Rhapsody 单细胞研究平台开展单细胞全转录组和靶向转录组测序服务，并以单细胞肿瘤临床研究为中心，着力进行单细胞甲基化检测等技术研发和应用，进而建立涵盖单细胞甲基化研究、单细胞转录组研究以及单细胞蛋白组研究的立体式系统解决方案，为单细胞研究提供新的解决方案和思路。 /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 聚焦单细胞肿瘤临床研究 /strong /span /p p 　　肿瘤研究的逐步深入和高通量测序技术的不断精进促使了精准医疗策略的提出。而解析肿瘤组织内细胞的高度异质性，是实现更精确的癌症分型，选择更合理的个体化治疗策略的迫切需求。针对肿瘤组织及其免疫微环境的单细胞转录组测序可以帮助科学家绘制肿瘤组织内细胞的异质性转录组图谱，通过鉴别肿瘤细胞、基质细胞与浸润淋巴细胞的不同细胞亚群，来解析不同细胞亚群生物学功能异同，最终构建肿瘤细胞及免疫微环境的互作网络，并探究肿瘤细胞产生耐药或免疫逃逸等机制。 /p p 　　中科普瑞单细胞测序平台可利用高通量单细胞转录组测序技术，通过揭示肿瘤发生发展进程中各种细胞亚群转录组的变化与差异，助力科学家开展肿瘤的早期诊断、病情监测及预后判断等方面的研究。 strong 中科普瑞还与国家大数据中心进行战略合作，结合大数据共享和应用分析，通过单细胞转录组研究整合多组学和临床数据，构建健康与疾病的信息网络数据库，以期为不同遗传背景的患者提供个体化诊断及精准治疗。 /strong /p p 　　同时，中科普瑞还将利用BD& reg AbSeq assay这一单细胞蛋白组分析利器，大幅提高客户对其感兴趣的稀有或未知细胞的检测能力，以促进药物治疗反应、细胞治疗等肿瘤免疫学应用研究的进展。 /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 聚焦单细胞甲基化研究 /strong /span /p p 　　近年来，基于血浆ctDNA甲基化的肿瘤早期诊断、溯源及预后的技术突破，为肿瘤风险筛查和防治提供了新的曙光。DNA甲基化还可用于疾病分型、预后以及用药指导等临床领域。单细胞甲基化检测技术在未来的疾病研究与临床应用中有着光明前景和无限可能，既可从单细胞水平研究DNA甲基化修饰在组织分化、发育过程中的特异性，帮助医生判断转移癌组织的原发病灶，进而明确诊断疾病 还可针对特定肿瘤组织DNA甲基化修饰的异常，进行对应的诊疗指导或药物开发。 /p p 　　2018年3月以来，中科普瑞作为中国十万人甲基化组计划(表观星图计划)的项目实施方，通过与国内外基因组队列计划联动，建立中国人甲基化基准数据库，为表观遗传领域研究、应用和临床检测等建立基础数据库。表观星图计划除利用甲基化芯片进行甲基化基准数据库的建立外，还将利用BD(China) — Sinotech Genomics(中科普瑞)单细胞研究联合实验室在单细胞研究方面的技术优势，聚焦单细胞甲基化研究，以期为肿瘤的风险筛查和预防提供新的手段。 /p