荧光原位

由大连化物所微型分析仪器研究组(105组)耿旭辉研究员、关亚风研究员团队与中科院深海科学与工程研究所共同研制的4500米级深海原位微生物、有色溶解有机物(CDOM)、叶绿素荧光传感器，于2022年10月至12月在南海科考航次中搭载深海原位实验室开展海试任务，最大潜深1384米，总工作时长超过40天，均工作正常、获得了有效数据，表明该三种深海原位荧光传感器具有优良的长期连续在深海海底原位工作稳定性。此外，合作团队共同研制的深海原位气相色谱仪搭载深海原位实验室，于2022年11月在南海科考航次中进行了2次海底试验，最大潜深1384米，4次海底原位采样分析均获得了有效数据。上述研究得到了中科院A类先导专项“深海/深渊智能技术及海底原位科学实验站”和大连化物所创新基金等项目的资助。

近日，华中农业大学教授曹罡、副研究员戴金霞团队在《自然—通讯》发表新一代效率高、特异性强、信号强和背景噪音低的荧光原位杂交方法—p-FISH rainbow，突破了现有的技术壁垒，克服了目前荧光原位杂交技术领域的缺陷和不足，可广泛应用于动物、植物和病原微生物中多种生物分子的高效检测、细胞亚群和空间图谱的原位注释、染色体变异原位验证、多重蛋白共同检测和短核酸序列的检测，为生命科学研究和临床诊断提供了有力的工具。生命体的细胞功能多样性源于细胞的异质性和组织环境的复杂性，确定组织环境中细胞类型和分子特性对于解析细胞—细胞相互作用和组织的功能机制尤为重要。近年来，尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）促进了细胞异质性的解析，却伴随着组织微环境和细胞空间信息的缺失，限制了对生命信息的深度解读。荧光原位杂交技术（FISH，fluorescence in situ hybridization）通过特异性杂交解析生物分子的表达水平和空间位置，极大地促进了细胞中基因空间表达信息的探究，加速了我们对组织微环境和功能机制的深入理解。尽管目前荧光原位杂交技术经过不断地改进已经取得了巨大的进步，但仍存在一些挑战：当前方法通常需要大约1kb或更长的核酸序列用于多个靶标探针的杂交，才能产生足够的信号强度，限制了对短核酸序的检测；只能单独检测DNA、RNA和蛋白质，或共同检测RNA和蛋白质，还没有有效方法同时检测DNA、RNA和蛋白质；如何在实现高杂交效率和高信号强度的同时，保证低背景噪音仍然是原位杂交技术的一个关键挑战。针对当前荧光原位杂交技术面临的挑战，该团队开发了杂交效率高、信号放大能力强、背景噪音低、特异性好、检测通量高、应用范围广的新型荧光原位杂交方法—π-FISH rainbow。该方法具备高度创新性和优越性。新型π型靶探针(含2-4个互补碱基对)和U形放大探针的设计使该方法比目前主流的FISH方法，如smFISH和HCR等，杂交效率更高、背景噪音更低和信号放大能力更强。该方法可以实现DNA、RNA和蛋白质多重分子的共同检测，这一突破对破译生物大分子复合物参与生命活动调控机制的研究具有十分重要的意义。目前的荧光原位杂交技术方法还无法克服短序列的限制，难以实现对短序列RNA（如microRNA）、短序列DNA（如DNA突变、倒位、异位）以及可变剪接等分子的检测。π-FISH rainbow方法可以高效检测上述短核酸序列分子的空间信息。该方法应用范围非常广泛，可用于动物、植物和微生物（细菌，病毒和寄生虫等）样品的检测，并且不拘泥于样本制备的限制，可适用于冰冻样本、石蜡样本和整体胚胎样本的检测。该研究利用π-FISH rainbow方法探究了重要的生物学问题并获得了新的发现。他们成功鉴定了前列腺癌患者循环肿瘤细胞中雄激素治疗抵抗标志物雄激素受体剪接变体7 (ARV7)，解决了前列腺癌治疗中缺乏精准诊断的难题，为前列腺癌患者雄激素耐药性治疗提供了重要的临床指导。该方法通过4个荧光通道组合编码，每轮可同时实现15个基因的检测，从而在同一张小鼠初级感觉皮层（S1）组织切片上通过两轮杂交检测了21个神经元的标记基因，不仅再现了小鼠S1皮层不同亚层神经元的空间分布，而且绘制了小鼠S1皮层中13个抑制性神经元亚群的空间图谱由于π-FISH rainbow的高灵敏度，该研究首次发现肿瘤细胞周期关键调控因子lncRNA MALAT1具有三种不同的亚细胞定位模式。其中，MALAT1的核聚集模式显示与miR145-5p的高度共定位。这些研究展现了π-FISH rainbow技术在基础科学研究和临床诊断中的巨大应用潜力。曹罡、戴金霞为共同通讯作者，博士研究生陶影峰和周小六为共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、广东省重点研发计划、中央高校基本科研业务费专项资金项目的资助。

3月17日，中国科学院深圳先进技术研究院合成微生物组学研究中心、深圳合成生物学创新研究院戴磊课题组，在《自然-通讯》(Nature Communications)上，发表了基于成像的空间微生物组最新研究成果(Spatial profiling of microbial communities by sequential FISH with error-robust encoding)。 　　该团队发展了一种可容错编码的序贯荧光原位杂交(SEER-FISH)技术，用于解析复杂微生物群落的空间结构。该方法可识别复杂群落中的不同微生物物种，在单细胞尺度上原位解析微生物物种之间以及微生物-宿主之间的相互作用，是探究微生物群落的生态和功能的重要工具。 　　自然界中的微生物群落具有丰富的物种多样性。各种微生物独特的生存方式和相互作用关系构成了群落特定的空间结构。尽管现有的高通量测序技术能够描绘微生物群落的物种组成及丰度，但缺乏解析群落空间结构的有力工具。由于传统荧光显微成像技术可分辨的物种数量受限于荧光基团的颜色种类，绘制高物种分辨率的复杂微生物群落的空间结构颇具挑战性。 　　基于此，研究发展了新的SEER-FISH成像技术并将其用于复杂微生物群落，在微米尺度上绘制了拟南芥根系定植的微生物群落的空间分布，观测到不同物种在根表上的空间异质性定植以及在受到宿主代谢物扰动后的空间分布变化和物种空间关联改变。SEER-FISH技术可以精准解析复杂微生物群落的空间结构，为探讨植物根际、人体肠道等宿主共生微生物组的生态规律和生理功能提供了有力工具。 　　SEER-FISH通过序贯荧光原位杂交的方式实现微生物群落空间结构的解析。它的工作原理是为每种微生物分配特定的多色编码，每轮使用带有相应颜色荧光基团的寡核苷酸探针来标记对应的微生物，再通过多轮荧光原位杂交成像获取每个细胞的多色编码，从而确定其对应的物种(图1a-c)。该团队进一步对编码进行优化，使用不同汉明距离(HD，hamming distance)的纠错编码可以提高物种准确识别率，且具有高度的可扩展性(图1d)。 　　研究在不同微生物群落的体外成像实验中对SEER-FISH技术进行系统评估。实验验证了该方法对群落组成识别的准确性和可重复性，能够准确量化群落物种组成的变化(图2a-c)，使用不同的编码方案所得到的群落组成高度一致(图2d-f)。 　　植物根际定植着高度多样的微生物群落。它们既受到植物宿主的调控又影响植物的生理健康。然而，科学家对于根际微生物群落的空间结构却鲜有研究。研究将SEER-FISH应用于根表微生物的空间成像，勾勒了不同生理分区分布定植的微生物群落组成 (图3a-c)。 　　研究发现，定植在根表的微生物群落并非随机分布，而是倾向于形成聚集体。这些微生物聚集体的尺度在几十到几百微米，并存在多个物种(图3d-f)。微生物聚集体的形成的具体原因有多种假说，包括偏好性定植、提高在根际环境下的适应性等。此外，研究通过对群落中的微生物进行邻近关系分析，发现了显著的菌-菌空间关联(图3g)。 　　通过外源添加拟南芥根际分泌的代谢产物植保素(camalexin)和香豆素(fraxetin)，研究发现根际微生物的组成和空间分布均发生了显著变化(图4a-c)。例如，中华根瘤菌主要定植于靠近根尖的位置，而这种偏好性的定植在加入植保素和香豆素后发生改变(图4d)。农杆菌本身在根上的定植没有偏好性，但在受到香豆素扰动后表现出更多的定植于根成熟区(图4e)。根际微生物空间分布的高度异质性和物种之间的差异，与环境异质性、微生物本身的特性均有关。 　　研究进一步对定植微生物的空间关联进行分析，发现植保素和香豆素均不同程度地影响改变了物种之间的空间关联(图4f)。微米尺度下的空间关联暗示了微生物群落中不同物种之间广泛存在的短程相互作用(如营养竞争与互养、接触抑制、群体感应等)，对于进一步的机制研究有重要的指导意义。 　　研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省自然科学基金及深圳合成生物创新研究院的支持。