荧光反应

摘要近日康宁AFR欧洲技术团队，基于紫外-可见光下(E)-偶氮苯的光异构化，开发了一种高效、低成本的多波长化学光量测量方法。由量子产率估算和1H NMR核磁共振分析表明，对于从紫外光到可见光范围的各种波长，结果都非常准确。研究者还通过对光化学反应器中光子通量密度的测定，核算N2-苯腙在405nm波长下的量子产率，对该方法进行了验证。小贴士量子产率：每吸收一个量子所产生的反应物的分子数，通常是对于特定的波长而言，即量子产率=（生成产物的分子数）/（吸收的量子数）。量子产率是进行光化学学动力学研究的重要参数。光子通量密度：表示单位时间单位面积上在特定波长范围内入射的光量子数。背景相对于批次间歇反应釜，连续流光化学反应器具有持液体积小、透光均匀、反应安全且重现性好等优点。随着单色度高、寿命长且能耗低的LED光源的发展，市场上涌现出了新一代高效的连续流光化学反应器，产能通量包括从实验室级（克/小时）到工业生产级（吨/天）。在上述背景下，为了量化通过光反应器的光子通量密度，帮助理解光化学反应机理，并能精确地描述光反应器在生产率变化时如何随时间变化和操作，迫切需要开发低成本和多功能的光量测量方法。然而，现有方法大多数都是基于昂贵的光量光度计和繁琐的程序，且极少有测定连续流微通道光化学反应器中接收光子通量密度的光量测量方法被报道。研究过程：一、理论模型与结果化学家们曾研究了大量一级光化学反应物质，这些物质在光的诱导下转化为另一种物质的速率可以被精确测量，并与入射的绝对光子通量密度相关联。在这类光化学反应体系中，光子被反应物R和产物P以不同的摩尔消光系数吸收，吸光度随时间而变化。作者在前人的研究基础上，建立了理论模型。并考虑到康宁Lab光化学反应微通道的几何形状，呈现了两个垂直于光源的平行壁，由于光路在通道的每个点上都是恒定的，到光源的距离也是固定的和恒定的。利用康宁连续流光学反应器来研究化学光量测量方法所面对的主要问题，是要对康宁微通道反应器的玻璃模块的玻璃层和换热层的光透射进行修正。图1.康宁LAB光化学反应器剖面图2017年，作者的团队报道了一种简单的方法，在溶剂中使用偶氮苯作为一种方便的光度计。该方法的主要优点在于偶氮苯的成本低和使用核磁共振作为一种定量光谱技术来简化动力学测量。图2. 偶氮苯的光异构化研究者展示了应用此方法在具有四个不同波长(365、385、405和475nm)的康宁® Lab光化学反应器进行光量测量，并给出了数据和拟合结果（以405 nm为例）：图3.康宁Lab光化学反应器中405 nm下的化学光量测量结果特定波长下（405nm），反应路径内的光子通量密度与光强之间的拟合公式如下：【编者语】康宁反应器不只是应用于工艺开发或者工业化生产，也适用于化学研究领域。不管是动力学理论研究，新的测量方法研究，还是新化合物的发明与发现，康宁反应器都有可能是您的得力助手。二、方法应用与验证：为了证明这种方法在连续流光化学反应动力学研究中的适用性，作者按照本文方法重新计算了isatin N2-phenylhydrazone的光量子产率（已知最近的文献中其光化学量子产率（ΦZ ≈ 1 × 10–3））。图3. 康宁实验室光化学反应器。前面铝箔覆盖包裹避免自然光照图4. isatin N2-phenylhydrazone 405nm异构化的光动力学研究 考虑到康宁Lab光化学反应器的通道极细(0.4mm)，为了保证足够的量进行1H NMR分析，浓度增加到2×10−3mol.L−1。在上述浓度条件下，吸收约为99% (ε z=12270L.mol−1.cm−1)，光子几乎全部吸收，可以通过核磁共振波谱进行非常精确的测量。由于康宁® Lab光化学反应器中良好的传热性能，温度可以保持在20°C，因此可以忽略热异构化的影响。由于Z-构型的氢键，E和Z异构体的浓度可以轻易的通过1H NMR进行定量。利用长停留时间确定了光静止状态。(Z)-异构体的甲醇溶液在405nm的不同停留时间照射，光功率为100%。 图5.isatin N2-phenylhydrazone的光异构化反应EPSS（0.20）被用作一个参数来绘制图ln (EPSS−E) 与时间的关系，它与相关系数表现出线性关系并具有良好的平方相关系数(R2=1.00) 。该图的斜率(0.070s−1)对应于公式：通过公式换算可以很容易的计算出量子产率ΦZ(1.1 × 10–3)，这一数据与文献数值非常接近。结果与讨论康宁欧洲技术团队开发的此光量测量方法为应用连续流光化学反应器进行光反应动力学研究提供了参考。鉴于此方法安全、简单易操作，它的应用可以扩展到更大规模的连续流光反应器(如康宁G1和G3光化学反应器)中作为例行分析测试手段。参考文献：Photochemical & Photobiological Sciences. 8 January 2022

化学创造着千变万化的物质世界，在这其中每一个单分子起到基本的作用。传统化学和生物学研究大量分子参与的反应和变化。著名物理学家埃尔温薛定谔曾评论过：“我们从来没有用一个单电子、单原子或单分子做过实验。我们假设我们可以在思想实验中实现，但是这会导致非常可笑的后果。”观察、操纵和测量最为微观的单分子化学反应是科学家面临的一个长久科学挑战。针对这一挑战，浙江大学化学系冯建东研究员致力于发展跨学科的单分子测量方法和仪器，实现多维度的溶液体系单分子物理和化学过程观测、新现象研究和应用建立。近期，其团队发明了一种直接可以对溶液中单分子化学反应进行成像的显微镜技术，并实现了超高时空分辨成像。该技术在化学成像和生物成像领域具有重要的应用价值，允许看到更清晰的微观结构和细胞图像。北京时间8月11日，这项研究成果作为封面论文刊登在国际顶级期刊《自然》。论文第一作者为浙江大学化学系博士生董金润和博士后卢禹先；论文通讯作者为浙江大学化学系冯建东研究员。 浙大团队的研究对象是电致化学发光反应。电致化学发光是利用电极表面发生的一系列化学反应实现发光的形式。相比于传统的荧光成像技术，由于不需要光激发，电致化学发光几乎没有背景，是目前对于灵敏度有着很高要求的体外免疫诊断领域的重要手段，其在成像分析等方向也具有一定价值。目前，电致化学发光存在两个重要的科学问题，其一是微弱乃至单分子水平电致化学发光信号的测量和成像，这对于单分子检测非常重要。其二是在电致化学发光成像领域实现突破光学衍射极限的超高时空分辨率成像，即超分辨电致化学发光成像，这一点对化学和生物成像具有重要意义。3年来，冯建东团队致力于这两大难题的研究，通过联用自制的具有皮安水平电流检出能力的电化学测量系统以及宽场超分辨光学显微镜，搭建了一套高效的电致化学发光控制、测量和成像系统。首次实现了单分子电致化学发光信号的宽场空间成像；并在此基础上成功突破了光学衍射极限，第一次实现了电致化学发光的超分辨成像。这项单分子电致化学发光显微镜技术不需要光激发即可实现单分子超分辨成像，有望影响化学测量和生物成像领域的应用。 在时空隔离中达到单分子反应测量极限教科书上的化学反应都是以单分子形式进行概念描述，但传统实验中得到却是大量分子的平均结果。单分子实验是从本质出发解决许多基础科学问题的重要途径之一，是研究方法的质变。这也是化学测量学面临的一个极限挑战。电致化学发光过程中，为什么难以开展单分子信号的捕捉呢？这主要是因为单分子反应控制难、追踪难、检测难。冯建东介绍：“单分子化学反应伴随的光、电、磁信号变化非常微弱，而且化学反应过程和位置具有随机性，很难控制和追踪。” 图1：单分子电致化学发光信号的时空隔离和随机性。为此，浙大科研人员搭建了灵敏的探测系统，将电压施加、电流测量、光学成像同步起来，通过时空孤立“捕捉”到了单分子反应后产生的发光信号。“具体从空间上通过不断稀释，控制溶液中的分子浓度实现单分子空间隔离。时间上，通过快速照片采集，最高在1秒内拍摄1300张，消除邻近分子间的相互干扰。”博士生董金润介绍到。利用这套光电控制和测量平台，浙大科研团队首次实现了单分子电致化学发光反应的直接宽场成像。“由于不需要光源激发，这一成像的特点在于背景几近于零，这种原位成像将为化学和生物成像领域提供新的视野。” 在单分子空间定位中突破光学极限显微镜是物质科学和生命科学研究的重要研究工具，传统光学显微镜在数百纳米以上的尺度工作，而高分辨电镜和扫描探针显微镜则可以揭示原子尺度。“在这个标尺中，能够用于原位、动态和溶液体系观测几个纳米到上百纳米这一尺度范围的技术仍然非常有限。”冯建东提到，主要原因在于光学成像分辨力不足，受到光学衍射极限限制。为此，冯建东团队接着着手从时空孤立的单分子信号实现电致化学发光的超分辨成像。 受到荧光超分辨显微镜（2014年诺贝尔化学奖）的启发，浙大研究者利用通过空间分子反应定位的光学重构方法进行成像。这就好比当人们夜晚抬头看星星时，可以通过星星的“闪烁”将离得很近的两颗星星区分开一样。“化学反应的随机性，通过空间上的发光位置定位，再把每一帧孤立分子反应位置信息叠加起来，构建出化学反应位点的‘星座’。 ” 图2：单分子电致化学发光显微镜在微纳结构成像上的论证。 冯建东说，为了验证这一成像方法的可行性以及定位算法的准确性，团队通过微纳加工的方法在电极表面制造了一个条纹图案作为已知成像模板，并对之进行对比成像。单分子电致化学发光成像后的结果与该结构的电镜成像结果结构上高度吻合，证明了成像方法的可行性。单分子电致化学发光成像将传统上数百纳米的电致化学发光显微成像空间分辨率提升到了前所未有的24纳米。 图3：单分子电致化学发光显微镜固定（死）细胞成像。 研究团队进而将该技术应用于生物细胞显微成像，不需要标记细胞结构本身意味着电致化学发光成像对细胞可能是潜在友好的，因为传统使用的标记可能会影响细胞状态。团队进一步以细胞的基质黏附为对象，对其进行单分子电致化学发光成像，观察其随时间的动态变化。成像结果与荧光超分辨成像可以进行关联成像对比，定量上表现出可以同荧光超分辨显微镜相媲美的空间分辨率，同时该技术避免了激光和细胞标记的使用。 图4：单分子电致化学发光显微镜活细胞成像。 未来，这项显微技术将作为一项研究工具为化学反应位点可视化、单分子测量、化学和生物成像等领域提供新的可能，具备广泛的应用前景。在同一期上，《自然》期刊专门邀请了领域专家对这一突破性技术的前景进行了亮点评述和报道。 该研究受到了国家自然科学基金委（项目号：21974123）、浙江省自然科学基金委（项目号：LR20B050002）、中央高校基本科研业务费校长专项（项目号：2019XZZX003-01）和浙江大学百人计划的经费支持。

近日，北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室教授章晓辉团队、北师大生命科学学院教授王友军团队与中国科学技大学教授唐爱辉团队合作开发构建了一类新型的检测钙信号的荧光蛋白探针“尼莫”（NEMO），该探针具有更强和更精准的定量测定性能。近日，该成果在线发表于期刊《自然-方法》。生命体的许多活动都离不开钙离子（Ca2+）信号分子。细胞内钙离子浓度时空变化被称之为钙信号，它控制或调节各种细胞生命活动。开发灵敏和精准的钙信号检测探针工具对探究生命活动相关的信号机制和规律至关重要。在相关领域内被广泛应用的钙探针主要包括有机小分子类探针和遗传编码的（荧光）蛋白探针（GECIs）。目前最被广泛应用的单荧光GECI工具为GCaMPs系列，它由钙感知和荧光反应两大模块组装构建而成。其中，钙感知模块包含钙结合蛋白（如钙调蛋白CaM）及其靶肽（如M13/RS20），产生荧光变化的模块为环化重排的绿色荧光蛋白cpGFP。科学家们发现，通过改变CaM、M13与GFP三个元件之间的连接方式，连接短肽及互作界面中的关键氨基酸等方式，可改善GECIs的表现。因此，在2001年最初构建的GCaMP1版本上多次迭代改造后，至2023年最新发展的GCaMP8系列具备了显著改善的灵敏度和反应速度，但它们的反应幅度，即对钙信号大小的分辨率和线性动态范围始终有待提高。对此，合作团队采用了全新策略构建的新型高灵敏钙离子探针。从增强GECI对钙离子浓度变化的的荧光反应大小出发，合作团队采用亮度更高的新型荧光蛋白mNeoGreen（mNG）来替换广泛使用的cpGFP，结合多种设计及优化策略组合，构建了含几十个候选复合分子的GECI库，并通过系统的钙离子成像筛选和体外鉴定后，最终获得到了一组名为NEMO的新型GECI探针。与现有的GCaMP系列探针相比，NEMO探针的灵敏度及钙响应幅度有了显著提升，在领域中首次实现GECI探针对细胞内钙信号的反应幅度超过100倍；同时具有更好的抗光淬灭能力与pH稳定性，并能实现对钙离子水平的绝对定量检测。合作团队进一步在对非兴奋性细胞系、分离培养的大鼠神经元、小鼠脑内神经元在体双光子激光成像和深部脑区光纤记录等测试中发现，相比于最新或最广泛使用的GCaMP8s或GCaMP6s，NEMO系列对胞内钙信号的反应速度相当，但更灵敏并具更高的信噪比，且反应幅度提高达约10倍之多。