酶联免疫法

摘　要:介绍了竞争酶联免疫吸附法测定猪肉中的盐酸克伦特罗的方法。利用盐酸克伦特罗试剂盒,对猪肉组织中残留的盐酸克伦特罗经抽提、竞争后,用酶标仪进行检测分析。此法较适用于现场检验,检测速度快、灵敏度高,是保证肉品卫生安全的较好监控方法。 酶联免疫吸附法是目前最佳的检测方法。ELISA 检测方法有双抗体夹心法测抗原、间接法测抗体、竞争法测抗体等。该文是利用酶联免疫吸附法中的竞争法测抗体,其原理是利用多克隆抗体既能与盐酸克伦特罗结合,也能与包被抗原结合。这些包被抗原被固定在酶标板孔壁上,当样品中含有瘦肉精时,它与包被抗原竞争结合抗体中有限量的结合位点。由于每一个孔中抗体的结合位点数相同,当样品中瘦肉精浓度低时,就有更多抗体的位点与包被抗原结合,更多的抗体被固定在酶标板壁上,就会与更多的酶标二抗结合,所以结果就呈现深兰色。相反,样品的瘦肉精浓度高,结果就呈现浅兰色。加入终止液后,兰色相应变成黄色,然后用酶标仪进行测定。利用竞争酶联免疫吸附法检测瘦肉精,具有速度快,灵敏度高的特点,适用于现场检测,对以后瘦肉精检测工作的发展具有指导作用。 1 　实验材料与方法 1.1 　原料的准备 抽取具有一定批量的有代表性的无皮猪肉,剔除杂质、脂肪。将精肉用高速捣碎机捣碎混合均匀,放置冰箱冷冻备用。取捣碎的样品5g ,加入25mL ,50mmolHCl 振动1.5h ,以达到均质。称取5g均质物(相当于1g 肝脏或肌肉),加入离心管中,10000r/min 离心15min。取上清液至另一个离心管中, 加1mol NaOH 300ul , 混合15min。加入4mL ,500mmol KH2PO4 (pH3.0),迅速混匀置于4摄氏度的冰箱内保存至少1.5h。10000 r/min 离心15min ,分离上清液。 1.2 　试剂 盐酸克伦特罗&mdash 酶联免疫试剂盒 1.3 　仪器 电热恒温水浴锅、酶标仪、离心机、匀浆机（HFJ系列内切式匀浆机，厂家：天津恒奥）、微量加样器。 1.4 　方法 1.4.1 　洗板　所有试剂回温至室温。将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10 倍。将酶联免疫板取出,放在室温下平衡5min。每孔加入300uL 洗液,放置1min ,再甩掉洗涤液,重复3 次,将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。 1.4.2 　竞争　试剂盒中的抗体按1∶1000 倍稀释。加样时在板上按1 到3 的顺序加入标样,每孔100uL ,重复两次,其它孔加入待测样品,每孔100uL 抗体,注意加入抗体时不要让枪头沾染孔里的样品与标准样,然后将酶标板放入湿盒里,在37摄氏度下竞争30min。 1.4.3 　加二抗　试剂盒中的二抗标记酶按1 :1000 稀释。在酶联板上每孔加200&mu L 配制好的二抗标记酶,将其放入湿盒,置37摄氏度、30min。 1.4.4 　加底物显色　取底物A、底物B 按等体积混匀,在酶标板上每孔加200&mu L 配好的底物显色板显色,显色后每孔加入50uL 的终止液终止反应。在酶标仪上测定各标准样和各样品450nm 处的光密度(OD)值,用瘦肉精标准液200ng/mL 孔作为0孔。 2 　讨论 2.1 　试剂盒的贮存 试剂盒在4摄氏度贮存。抗体和酶标二抗(IGg-HRP)在常温下容易变性,须冷冻保存,使用时直接拿出按比例稀释。 2.2 　加样 实验中有3 次加样步骤,即加标本、酶结合物和底物。加样时应将所加物用微量加样器加在ELISA板孔的底部,可用左手扶住微量加样器的中部,避免加在孔壁上部,并防止溅出和产生气泡,导致实验误差。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,使加液过程迅速完成。 2.3 　保温 在实验中有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation)或孵育。因为ELISA 属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。温育的温度通常是37摄氏度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。两次抗原抗体反应一般在37摄氏度经1～2h ,产物的生成可达顶峰。为加速反应,可提高反应的温度,但最高不要超过43摄氏度。保温的方式采用水浴,将板置于不锈钢电热恒温水浴锅中,注意可将ELISA 板置于水浴箱中,ELISA 板底应贴着水面,使温度迅速平衡。为避免蒸发,板一次不宜多于两块板同时测定。 2.4 　洗涤 洗涤在ELISA 法过程中是很关键的一步。ELISA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。如果洗板被污染或洗涤用水被游离的酶标记物污染、洗涤次数不够或注水量不足、洗板后间隔时间太久致使板孔干燥等都会直接影响检测的最终结果,严重者实验不产生颜色致使实验失败。 2.5 　显色和比色 显色是ELISA 中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。酸性终止液H2SO4 会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标准96 孔的座架中,才可进行比色。并在加底物液显色前将软板边缘剪净,以使软板完全平妥坐入座架中。比色时应以200ng/mL 校零点,且孔在边缘。然后依次测量不同浓度下的OD 值。

7月7日，记者从广东工业大学获悉，该校生物医药学院教授赵肃清团队与美国加州大学戴维斯分校合作，首次制备出高亲和力的可溶性环氧化物水解酶抑制剂（EC5026和TPPU）纳米抗体，并用于开发灵敏的间接竞争性免疫分析传感器。相关研究论文发表于《药物分析学报》（Journal of Pharmaceutical Analysis）。该论文第一作者为杨慧怡，通讯作者为赵肃清和Bruce D. Hammock。　　该研究以可溶性环氧化物水解酶抑制剂（EC5026和TPPU）为分析物，报道了一种基于纳米抗体的酶联免疫分析传感器的构建与应用，该传感器能够实现灵敏地、准确地对抑制剂给药后临床人体样品中抑制剂含量的监测。可溶性环氧化物水解酶抑制剂在各种动物模型中都是有效的神经性疼痛镇痛药，其中EC5026已成功通过美国FDA人体1a期试验，TPPU因其优异的药代动力学特征、靶效和体内生物活性被广泛应用于研究。　　该研究首次制备了高亲和力的EC5026和TPPU纳米抗体，并用于开发灵敏的间接竞争性免疫分析传感器。该传感器具备较高的精密度和准确度。研究表明，纳米抗体为小分子药物的临床开发和治疗过程中的监测提供了质谱法的替代和补充分析工具。

Two enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were tested for their suitability for detecting sulfonamides in wastewater from various stages in wastewater treatment plants (WWTPs), the river into which the wastewater is discharged, and two swine-rearing facilities. The sulfamethoxazole ELISA cross-reacts with several compounds, achieving detection limits of 0.04 &mu g/L for sulfamethoxazole (SMX), sulfamethoxypyridine, sulfachloropyridine, and sulfamethoxine, whereas the sulfamethazine (SMZ) ELISA is more compound specific, with a detection limit of 0.03 &mu g/L. Samples from various stages of wastewater purifications gave 0.6-3.1 &mu g/L by SMX-ELISA, whereas river samples were &sim 10-fold lower, ranging from below detection to 0.09 &mu g/L. Swine wastewater samples analyzed by the SMX-ELISA were either at or near detectable limits from one facility, whereas the other facility had concentrations of &sim 0.5 &mu g/L, although LC-MS/MS did not confirm the presence of SMX. Sulfamethazine ELISA detected no SMZ in either WWTP or river samples. In contrast, wastewater samples from swine facilities analyzed by SMZ-ELISA were found to contain &sim 30 &mu g/L [piglet (50-100 lb) wastewater] and &sim 7 &mu g/L (market-weight hog wastewater). Sulfamethazine ELISA analyses of wastewater from another swine facility found concentrations to be near or below detection limits. A solid phase extraction method was used to isolate and concentrate sulfonamides from water samples prior to LC-MS/MS multiresidue confirmatory analysis. The recoveries at 1 &mu g/L fortification ranged from 42 ( 4% for SMZ to 88 ( 4% for SMX (n ) 6). The ELISA results in the WWTPs were confirmed by LC-MS/MS, as sulfonamide multiresidue confirmatory analysis identified SMX, sulfapyridine, and sulfasalazine to be present in the wastewater. Sulfamethazine presence at one swine-rearing facility was also confirmed by LC-MS/MS, demonstrating the usefulness of the ELISA technique as a rapid and high-throughput screening method. 参考文献：酶联免疫法检测水中磺胺类药物.pdf