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20世纪基因组学研究取得的巨大成就为蛋白质组学的发展奠定了基础。蛋白质组学是从整体水平上分析生命体、组织或细胞的蛋白质组成及其活动规律的科学,以基因表达产物为研究对象,延伸了基因组学研究深度,更深层次地揭示了生命活动规律。蛋白质组学的研究内容主要包括蛋白质表达存在方式(修饰形式)的鉴定、结构与功能分析、蛋白质定位、蛋白质差异表达以及蛋白质间相互作用分析等[1]。目前蛋白质组学研究技术主要包括:二维电泳技术、蛋白质芯片技术、质谱技术等[2]。其中,二维电泳技术是早期蛋白质组学的重要技术之一,但是由于实验步骤多,耗时长,重复性差等特点,已经逐步被新型技术所取代。蛋白质芯片技术是将多种蛋白质纯品点于芯片表面,形成蛋白质矩阵进行免疫等标记反应,主要受限于很多蛋白质无法获得纯品而不能用于芯片制备。质谱技术由于灵敏度高、特异性强、分析范围宽等优点逐渐成为蛋白质组学的主要研究手段,可以对特定生命过程中的功能性蛋白质分子进行定性和定量检测,因此在基础科研和临床研究中得到了广泛的应用[3,4]。一、基于质谱的蛋白质组学技术1.基于质谱的蛋白质组学定性技术:蛋白质定性鉴定的基本原理在于:蛋白质组的基本序列已经通过基因组学信息获得,可以用来鉴定多肽的氨基酸序列,并且获得多肽与蛋白质的对应关系[1],即质谱提供的多肽碎片数据可以与蛋白质数据库自动匹配来确定多肽序列与蛋白质归属。基本技术策略分为:(1)自上而下(Top–down)策略[5],即完整蛋白质在质谱中进行分析,可以提供完整蛋白质的质量数,但是由于质谱仪受到质量分析范围的限制,此方法在常规实验室不易实现。(2)自下而上(Bottom–up)策略[6],即蛋白质被蛋白酶水解成多肽,然后对多肽进行质谱分析和碎裂。基于这条策略的大致步骤为:蛋白质样品首先经过酶解降解为多肽,然后对多肽进行色谱–质谱分离与鉴定,最后通过搜索引擎(MASCOT:http://www.matrixscience.com/server.html, SEQUEST:http://fields.scripps.edu/sequest等)在公共蛋白质组学数据库(SWISS–PORT: http://web.expasy.org/groups/swissprot, NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed等)中自动完成质谱数据的解析,确定多肽序列与蛋白质种类。该技术灵敏度高,特异性好,仪器自动化程度高,可以鉴定出生物样品中成千上万种蛋白质,被认为是大规模、高通量蛋白质定性检测的首选方法。2.基于质谱的蛋白质组学相对定量技术:对于大多数生命科学和医学研究来说,仅完成样品中蛋白质组的定性研究是远远不够的,还需要对蛋白质组进行定量分析。由于组学的研究对象是多个蛋白质,单次检测很难实现所有蛋白质的绝对定量,因此蛋白质组学定量多为相对定量检测。蛋白质组学定量的质谱技术包括谱图计数、质谱峰强度定量、同位素定量技术等。其中使用同位素作为内标定量的方法是目前质谱定量的最佳手段,即对整体蛋白质组进行同位素标记,并使用每一种天然蛋白质与同位素蛋白质的比值进行相对定量分析。主要分为细胞层面标记和蛋白质层面标记两种技术路线:(1)细胞层面标记的细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)方法[7]:即在两种细胞样品中分别加入轻重同位素标记的培养基,经过传代培养后,两种细胞样品中的全部蛋白质中分别嵌合了轻重同位素,可以在质谱上根据同位素的不同质荷比直接判断样品来源并进行定量比对。(2)蛋白质层面标记:使用含有同位素的小分子与样品全部蛋白质直接标记,如同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)[8]、同位素编码亲和标记(isotope–coded affinity tag,iCAT) [9]、18O标记[10]等方法,此类方法使用带有稳定同位素的小分子与特定氨基酸侧链反应,使得多个样品可以分别连接含有不同同位素个数(多至8个)的小分子,从而产生一级数据相同但是二级数据不同的质谱谱图,通过二级谱图强度比对进行多个样品的定量分析。3.基于质谱的目标蛋白质绝对定量技术:质谱技术对目标蛋白质的绝对定量检测主要通过质谱多反应监控技术与同位素多肽内标技术联用来实现[11]。该方法首先选定目标蛋白质的一个或多个多肽,合成序列相同但含有稳定同位素的多肽作为内标,定量加入样品中,通过监测特定多肽及其同位素多肽的质谱峰强度进行比对和计算获得目标蛋白质的定量值。质谱多反应监控技术通过进行母离子筛选与子离子筛选等二次选择过程,筛选出目标蛋白质,而非目标蛋白质由于无法通过筛选达到检测器,极大降低了噪音干扰。因此,此方法针对性强,本底噪音低,是目前质谱技术中定量能力最好的一种,可以控制变异系数小于15%,检测限低至纳克每毫升,适合血液、组织等临床样品的定量检测[11]。二、质谱技术发现肿瘤蛋白质标志物质谱技术作为一项强有力的研究工具在科学研究中发挥着巨大的作用,特别在肿瘤相关研究中,目前已经获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的肿瘤标志物包括多种蛋白质前列腺特异性抗原(prostate–specific antigen, PSA), 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA), 人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,Her–2), 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG), 糖类抗原CA125等,均揭示了蛋白质与肿瘤发生发展密切相关。这些已有成果极大促进了质谱技术在肿瘤蛋白质标志物研究中的应用,并取得了标志性进展。例如:美国约翰霍普金斯大学的Chan课题组发现了新型卵巢癌蛋白质标志物,他们使用表面增强激光解析电离质谱技术(surface enhanced laser desorption and ionization time–of–flight mass spectrometry, SELDI–TOF MS)技术对503个妇女的血清进行了蛋白质组学的分析[12],在随后的大量临床验证中最终确定CA125、β2微球蛋白,转铁蛋白,甲状腺运载蛋白和载脂蛋白A1的联合检测可以作为卵巢癌的新型临床诊断指标。2009年9月该试剂盒OVA1(商品名称:http://ova–1.com)获得了美国FDA的认证,进入临床使用,被认为是国际肿瘤蛋白质标志物研究的重要标志性成果。同时,肿瘤仍然是国际上致死率最高的疾病之一,缺乏早期检测技术和有效治疗方案,临床中还存在着大量问题需要解决,新型标志物的研发迫在眉睫。由于肿瘤蛋白质标志物研究的难度大,风险高,因此近十年来仅有几例试剂盒获得了美国FDA批准,进入临床使用。大量标志物研究还停留在论文研究水平,其中临床问题、研究思路和技术方案的选择直接关系到研究的成功与否。1.临床问题选择:在肿瘤蛋白质标志物研究中,临床问题的选择是研究核心。在肿瘤研究中,需要解决的临床问题往往包括肿瘤早期检测、肿瘤分期检测、治疗方案与药物选择、疗效评估等多个方面。研究者需要根据不同肿瘤的临床情况,具体分析并凝练不同肿瘤的主要临床问题。例如,对于病程发展快、五年存活率低、没有有效手术或化疗手段的肿瘤,早期诊断是研究重点,如胰腺癌、卵巢癌、肺癌等;对于病程发展慢、手术效果明显的肿瘤,肿瘤的愈后与复发是需要关注的问题,如前列腺癌、肠癌等;还有一些肿瘤有特殊的检测需求,如乳腺癌虽然有临床有效的雌激素受体(estrogen receptor,ER),孕激素受体(progesterone receptor,PR),HER2等基因标志物,可以进行药物靶点治疗,但是三阴性乳腺癌的检测还缺乏有效的标志物与治疗方案。因此,在肿瘤蛋白质标志物研究实验开展之前,明确临床问题,并以此确定临床样品入组标准,是研究成功的核心基础。2.研究思路设计:不同于基础科学实验,临床实验需要在大量样本中进行实验结果的验证,因此肿瘤蛋白质标志物研究往往包括新型标志物发现和验证两部分。标志物发现实验是在疾病组和对照组之间进行蛋白质组学分析,鉴定样本中的未知蛋白质组并进行相对定量比较,分析数据选择出在两组样本中差异最大的一个或几个蛋白质作为新型标志物的候选物。随后,标志物验证实验在大量未知样本中进行蛋白质候选物的定量检测,使用发现实验中建立的区分标准进行判读,计算检测灵敏性(sensitivity)和特异性(specificity)。有效的蛋白质标志物研究往往需要发现与验证的两步设计思路来相互保证。3.技术方案选择:根据蛋白质标志物研究的两步设计思路,发现实验中使用基于质谱的蛋白质组学定性技术与相对定量技术对样本中的大量未知蛋白质进行分析,获得标志物候选物名单。验证实验中根据已有名单,进行目标蛋白质(非蛋白质组学)的精确定量检测。这几种质谱技术的配合使用,可以满足不同实验情况和目的,最终实现新型蛋白质标志物的成功研发。三、展望质谱技术是现阶段蛋白质组学研究的核心技术,具有灵敏度高、特异性强、分析通量大等优势,特别是其与同位素内标的联合使用,大大提高了质谱定量能力,因此在多种肿瘤标志物研究中取得了突破性进展并被广泛应用。目前,大量肿瘤蛋白质标志物候选物已经通过使用质谱技术被从血液、组织、体液中筛选出来,预计在完成大规模临床验证后可以作为新型标志物在临床使用,促进肿瘤检测水平的发展。同时值得注意的是,质谱技术还不具备进行蛋白质组的绝对定量能力。相对于免疫等传统蛋白质检测技术,仪器昂贵,操作复杂,自动化程度低,这些因素决定了质谱目前适用于蛋白质的临床研究,但不适用于蛋白质的临床检验,这是质谱技术面临的重要挑战之一。参考文献[1]何华勤. 简明蛋白质组学[M]. 北京:中国林业出版社, 2011:1,76,85-95,119,125-138.[2]RuediA, MatthiasM. Mass spectrometry-based proteomics[J]. Nature, 2003, 422(13):198-207.[3]甄艳, 施季森. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J]. 南京林业大学学报:自然科学版, 2011, 35(1):103-108.[4]孙瑞祥, 付岩, 李德泉,等. 基于质谱技术的计算蛋白质组学研究[J]. 中国科学E辑信息科学, 2006, 36(2):222-234.[5]WhiteleggeJ,HalgandF,SoudaP, et al. Top-down mass spectrometry of integral membrane proteins [J]. Expert Review Proteomics, 2006, 3(6):585-596.[6]ChaitBT. Mass spectrometry:bottom-up or top-down? [J]. Science, 2006, 314(5796):65-66.[7]TranDT, AdhikariJ, FitzgeraldMC. StableIsotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC)-based strategy for proteome-wide thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions [J]. Mol Cell Proteomics, 2014,13(7):1800-1813.[8]DytfeldD, KandarpaM, StrahlerJR, et al. Proteomic Profiling of Multiple Myeloma (MM) Cells Using iTRAQ and Label-Free Quantitative Proteomics for the Prediction of Complete or near Complete Response (CR/nCR) In Frontline Treatment with Lenalidomide, Bortezomib, and Dexamethasone [J]. 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[align=left][font='calibri'][size=16px]外泌体[/size][/font][font='calibri'][size=16px]作为标志物用于肿瘤的早期诊断[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]外泌体是一种磷脂双层膜包裹的生物纳米颗粒,直径为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]30-200 nm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。近年来,由于外泌体携带大量遗传物质,在介导细胞[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞间通信中发挥重要作用,已成为液体活检最理想的分析目标。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]肿瘤生物标志物的检测可以协助肿瘤的早期诊断和治疗。近年来,外泌体在肿瘤的发生发展过程中显示出重要的作用,逐渐成为重要的诊断生物标志物和治疗靶标。肿瘤来源的外泌体携带分子和基因载体,反映了肿瘤细胞的部分组成,广泛分布于血液和包括尿液在内的其他体液。这些外泌体可以作为一种微创的液体活组织检查,对肿瘤进行实时的非侵入性分析,帮助疾病的临床诊断。外泌体作为疾病诊断和预后的标志物,相比于传统的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]miRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]分子具有明显的优势。肿瘤细胞衍生的外泌体携带的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]mRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]miRNAs[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和蛋白质等生物活性分子通常构成了肿瘤细胞的总蛋白质组或转录组的一部分,反映了亲本细胞的遗传信息。而且这些生物活性分子由于受到外泌体双层膜结构的保护使其在运输过程中不被降解。此外,这些外泌体在不同的储存情况下,包括在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃下短期储存[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]96 h[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]或在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-80[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃下长期储存,都具有很强的活力。外泌体的这些特性使其成为癌症诊断、预后和治疗反应的重要监测指标。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]多项体外研究表明,通过应用蛋白质组学和转录组学的方法,使用外泌体及其内容物和表面蛋白可以更早地发现癌症,从而提高预后和生存率[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][43][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。结肠癌患者血浆标本中外泌体水平的提高与肿瘤细胞的整体存活率的下降有相当大的联系[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][32][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。另一项研究表明,外泌体上的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD24[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EDIL3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和纤维连接蛋白被认为是早期乳腺癌的标志物。此外,在非小细胞肺癌的外泌体中,研究人员发现表皮生长因子受体([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EGFR[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])、胎盘碱性磷酸酶([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PLAP[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])和富亮氨酸的α[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-2-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]糖蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]LRG1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])的过表达。最近的报告显示,使用无标记的液相色谱[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]串联质谱([/size][/font][font='times new roman'][size=16px][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])检测前列腺癌患者的尿液,研究人员发现存在于尿外泌体中的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PCA3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]TMPRSS2:ERG[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白是潜在的生物标志物。这些发现表明从体液中分离得到的外泌体可能是肿瘤早期检测的重要非侵入性标记物。[/size][/font]
农残检测版块我看大部分作品都是仪器检测方面的内容,可是农药残留现在不单单是残留本身的问题了,还有对作物本身的影响及这些受影响的作物人体摄入后又有哪些变化呢?很少提及!另外,农药残留如果单从仪器检出方面来评估的话,可能对整个地区的横断面的描述缺乏论据,如果我们能找出一个预警的信号,根据这个信号有针对性的检测,相比工作效率事半功倍,而且对这个地区农残的危害可以有一个预见作用。 因此,出于以上考虑,我把自己近期的一个课题摘要,跟大家分享一下,欢迎批评指正,也希望对大家有所启发。探讨细胞色素P450酶系作为农药残留生物标志物的可行性目的和意义农药使用范围不断地扩大,新型农药不断涌现,这必然造成对农作物和环境的污染。因此及时、准确地对污染情况进行分析、监测,减少和防止对农作物和环境的污染以及对污染情况进行评估显得刻不容缓。传统的监测和评估是利用现代化仪器和手段进行准确定量的理化分析,但有些农药代谢分解迅速不易检出,而且仅凭含量无法反映这些农药对生物的效应,要检测和评估其对生物和环境质量的影响,就要研究在农药作用下生物体内各种指标的变化。生物标志物(biological marker)就适应了这种需要。生物标志物是指生物体由于接触外源毒物后而产生可在生物介质中测定到的细胞、生物化学和生物分子的改变,主要包括机体酶系统、细胞内的DNA、蛋白质、、谷胱甘肽、抗坏血酸以及结构生理生化功能等。细胞色素P450酶系是生物体中最重要的一组代谢酶,可由许多内源性和外源性的化学物质诱导。利用P450酶系的诱导作用,可以将其作为毒物污染机体在分子水平上敏感的生物标记物。农药作为外源性毒物,生物体在遭受其污染后会诱导P450酶系进行解毒。因此,本研究项目探索细胞色素P450酶系作为农药污染生物标志物的可行性。拟用常用农药胁迫生物体,检测生物体内细胞色素P450酶系总量的变化,搞清常用农药不同浓度胁迫生物体后与生物体内细胞色素P450酶系剂量-效应关系以及细胞色素P450酶系各个家族、亚家族的诱导效应,找出农药污染后体内细胞色素P450酶系中变化较特异的家族或亚家族,作为农药污染后特异的诊断评估工具,可为我国环境质量评价、化学物毒性评价、生态风险评价与预警系统提供理论依据国内外研究进展细胞色素P450酶系是生物体中最重要的一组代谢酶,根据酶的氨基酸序列相似性,细胞色素P-450酶系被分类并命名为家族(CYP1,2,3)、亚家族(A,B,C…)、单个基因(A1,2,3…),当前发现的P450基因超家族包括36个基因家族,其可由许多内源性和外源性的化学物质诱导。利用P450酶系的诱导作用,可以将其作为毒物污染机体在分子水平上敏感的生物标记物。目前国内外非常重视污染物监测的生物标志物研究,肝细胞色素P450酶系的诱导已被提出作为评价环境污染状况的最灵敏的生物学反应之一。国内外很多学者研究了野生动物、鱼类、蚯蚓、小麦等生物细胞色素P450酶系对多环芳烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)污染的指示作用,对哺乳动物和鱼类研究主要集中肝细胞色素P4501A1,因为与该细胞色素结合的EROD(乙氧基异酚唑酮)便于检测,而对于植物细胞色素P450酶研究则集中考察其总量的变化上。有关生物体细胞色素P450酶系作为常用农药污染的生物标志物的研究少见报道,有些只研究特定农药污染水体后葱属植物的EROD的指示作用。对所涉及的细胞色素P450酶系各个家族对农药污染后指示作用的系统研究未见报道。对于农药污染后体内细胞色素P450 酶系总量及各个家族亚家族含量变化较特异的指示生物的研究亦未见报道,对生物体细胞色素P450酶系作为农药污染空气、土壤、水体的生物标志物的系统研究尚属空白。技术发展趋势:1. 细胞色素P450将作为农药残留的长期生物效应的诊断工具,考察农药残留的危害性。[/